Presentacin de PowerPoint

1
Pontificia Universidad Católica de ChileFacultad
de Ciencias BiológicasDepartamento de Genética
Molecular y MicrobiologíaLaboratorio de
Bioquímica
Contra-defensa viral siRNA y su rol en la
supresión del silenciamiento génico mediado por
virus en plantas
Paola Canón Guidetti Junio, 2004
2
Introducción
Silenciamiento génico gen RNA
proteína
DNA? evitando la expresión
del gen (SGT)
RNA?evitando que sea


traducido (SGPT)

• Silenciamiento a nivel del RNA
• dsRNA? formación de RNAs pequeños

• este proceso se encuentra altamente conservado a
  lo largo de la evolución.
• ANIMALES RNA de interferecia (RNAi)
• HONGOS quelling
• PLANTAS silenciamiento génico post-transcripciona
  l (PTGS)

3
Introducción
miRNA
siRNA
4
Introducción
siRNA
5
Modelo de silenciamiento génico
post-transcripcional
Introducción
VIRUS
ssRNA
(RISC)
Plasterak, R.H.A. (2002) Science 2961263-1265
6
Modelo de silenciamiento génico
post-transcripcional
Introducción
VIRUS
ssRNA
Amplificación de la señal de silenciamiento
(RISC)
Plasterak, R.H.A. (2002) Science 2961263-1265
7
Introducción
RNasa clase III
RISC
P
P
8
Introducción
siRNA
9
Supresores virales del silenciamiento génico
Introducción
10
Supresores virales del silenciamiento de RNA
Introducción
HC-Pro
p19
11
Mecanismos de acción de supresores virales
Introducción
Chapman, E. y cols. Genes Develop. 181174
(2004)
12
Proteína p19 de Tombusvirus
Introducción
Proteína
ProteínaReplicasas Cubierta
Movimiento
pX ?
p19
ssRNA 4.8 kb
p41 p22
p33 p92
RNAsg 1 RNAsg 2
?Indispensable para la replicación
RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp)
Microscopía electrónica de Tomato burshy stunt
virus (TBSV)
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p19 suprime el silenciamiento mediado por siRNA
Antecedentes
p19 suprime el silenciamiento p19 une siRNA 21
nts in vivo (actividad supresora del
silenciamiento) Plantas-P19 ? siRNAs de menos
tamaño
Plant Cell 2004, Dunoyer P.
14
Estructura del complejo p192siRNA
Antecedentes
P19 permitiría el acceso de una endonucleasa al
extremo 3 libre
Current Biology 14R198 (2004)
15
siRNA de 19 ntsromo inducen menor grado de
silenciamiento
Antecedentes
Drosophila melanogaster
EMBO J 20 6877 (2001)
16
Antecedentes
Considerando que...

• p19 es un supresor del silenciamiento génico
• p19 genera siRNA de 19 nts in vivo
• siRNA de 19 nts son menos eficientes en inducir
  el silenciamiento en Drosophila

RISC reconoce siRNA de 21 nts con extremos
cohesivos
17
Hipótesis p19 induce un corte del extremo 3
libre (2nts) del siRNA para contrarrestar el PTGS
mediante la interacción con nucleasas
18
Hipótesis p19 induce un corte del extremo 3
libre (2nts) del siRNA para contrarrestar el PTGS
mediante la interacción con nucleasas
TBSV
ssRNA
19
Hipótesis p19 induce un corte del extremo 3
libre (2nts) del siRNA para contrarrestar el PTGS
mediante la interacción con nucleasas
TBSV
? ?
ssRNA
Complejo RISC
PAZ
20
Estrategia experimental

• Evaluar si los siRNA de 19 nucleótidos de
  extremos romos son incapaces inducir el
  silenciamiento de un gen reportero en plantas

a
a
b
b
siRNA GFP
21
Estrategia experimental

• Determinar si existen proteínas que interactúan
  con p19
• Ensayos de pull-down o inmunoprecipitación con
  anticuerpo anti-Tag, usando GST-p19 o p19-Tag,
  respectivamente. Ensayos con extractos celulares
  de plantas infectadas y no infectadas. Controles
  GST solo y anticuerpo inespecífico.
• Screening de una genoteca de expresión de Tomate
  o Nicotiana benthamiana, utilizando el supresor
  p19 marcado.
• Mediante herramientas bioinformáticas, poder
  establecer algún dominio funcional en la(s)
  proteína(s) encontradas, ojalá! posible dominio
  nucleasa
• 4. Utilizando sustratos sintéticos, probar la
  acción de la proteína X, y hacer ensayos
  funcionales, mutando la proteína y evaluando la
  inducción del silenciamiento.

22
(No Transcript)