Diapositiva 1

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Vectores de clonación
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Plásmidos
Extracromosómicos Circulares Replicación
autónoma (secuencia ori) Basados en plásmidos
naturales. Útiles para fragmentos de hasta 15
kbp aprox. Componentes esenciales Origen de
replicación. Gen de resistencia a
antibiótico(s) Polylinker (MCS) Selección
presencia inserto (plásmidos clonación) Sistema
de expresión (plásmidos expresión)
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Un ejemplo de vector plasmídico pUC18/19
pUC19
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Un esquema clásico de clonación en un vector
plasmídico
DNA a clonar
Vector plasmídico
DNA ligasa
Vector recombinante
Transformación de células de E. coli competentes
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El ciclo lisogénico-lítico del bacteriofago l
E. coli
Unión del fago, penetración y liberación del DNA
Lisis y liberación de partículas víricas
Circularización del genoma del fago (secuencias
cos)
Inducción del ciclo lítico
Integración y replicación con el genoma bacteriano
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Fago lambda
Genoma de unos 45.000 bp Fragmento central de
unas 15 kbp no es esencial para la replicación y
puede ser eliminado
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El fago lambda como vector de clonación
Vectores de inserción
lgt10
lgt11 (bibliotecas de expresión)
Vectores de substitución
lEMBL4
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El fago lambda como vector de clonación
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Cósmidos
Pequeñas moléculas de DNA circular (5-7 Kbp)
Secuencia ori Marcadores de selección
Secuencia COS permite el empaquetamiento como
bacteriófago para la infección en E. coli pero
se mantiene en la céula como un
plásmido. Permite clonar fragmentos de hasta 45
Kbp. Apropiados como vectores en fases iniciales
de proyectos de secuenciación
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(No Transcript)
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BACs (BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOMES)
Insertos entre 100 y 300 kbp Resistencia
antibiótico Estabilidad mediante ori. Una o dos
copias por célula. Cepas de débil pared celular
(electroporación)
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YACs (YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOMES)
Elementos básicos de un cromosoma Secuencias
ARS (Autonomous replication sequence) Secuencias
CEN (Centrómero) Secuencias TEL
(Telómero) Posibilidad de replicarse en E. coli
y en levadura. Insertos del orden de 1-2 Mbp.
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Clonando grandes fragmentos de DNA en YACs
Transformar, seleccionar y amplificar en S.
cerevisiae
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Clonando grandes fragmentos de DNA en YACs
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Construcción de una biblioteca de cDNA Síntesis
de cDNA
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Construcción de una biblioteca de cDNA
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Análisis de una biblioteca de cDNA
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Técnicas de mutagénesis dirigida
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Técnicas de mutagénesis dirigida
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Técnicas de mutagénesis dirigida
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Ejemplo de mutagénesis identificar resíduos
fosforilados
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(No Transcript)