Sin ttulo de diapositiva

1
OBJETIVOS
OBJETIVOS
Diferenciar los formatos de inmunoensayo y
conocer la ecuación de la curva dosis-respuesta
característica en cada caso
Describir las características de inmunoensayos
que emplean distintos tipos de marcadores
Seleccionar el formato de ensayo más
adecuado para cada aplicación analítica
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INMUNOENSAYOS CON MARCADORES
1. Introducción. Formatos de ensayo 2.
Inmunoensayos con radioisótopos como
marcadores 3. Enzimoinmunoensayos a. Enzimas
más utilizados como marcadores b.
Enzimoinmunoensayos heterogéneosELISA b.
Enzimoinmunoensayos homogéneos EMIT 4.
Fluoroinmunoensayos a. Fluoroinmunoensayos
homogéneos b. Fluoroinmunoensayos
heterogéneos 5. Aplicaciones analíticas

• BIBLIOGRAFÍA
• E. P. Diamandis, T. K. Christopoulos (eds.)
  Immunoassay Academic Press. San Diego. 1996
• C. P. Price, D. J. Newman (Eds.) Principles and
  Practice of immunoassays 2nd Edition. Stockton
  Press. Nueva York. 1997
• C. M. O Donnell, S. C. Suffin Fluorescence
  Immunoassays Anal. Chem. 51 (1979) 33A-40A.

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TEORÍA DE ENLACE- MODELO DE SCATCHARD
Reacción independiente entre cada uno de los
sitios de enlace en la molécula de Anticuerpo (s)
y la molécula de antígeno L
Ac(s) Ag (L) AgAc
inicial
N T
equilibrio
N-B F
B
N concentración total de s T concentración
total de L B AgAceq F Ageq T B F
Principio general de los inmunoensayos
La distribución de un analito entre las formas
libre y enlazada (B/T o B/F) se relaciona
cuantitativamente con T
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4
Monitorización de la distribución del
analito entre las formas libre y enlazada
Empleo de una concentración fija de analito
marcado (Trazador) y medida de B o F
Separando Ag libre y enlazado Ensayo
Heterogéneo
Si la unión Ag-Ac modula la actividad de la
marca, sin separar Ensayo Homogéneo
Señal medida f(B) Respuesta Concentración total
de analito (T) Dosis Curva de calibración Curva
dosis-respuesta
DISEÑO DE INMUNOENSAYOS
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TIPOS DE MARCADORES UTILIZADOS EN INMUNOENSAYOS
MARCADOR
EJEMPLO
14C, 3H, 32P 125I, 57Co
RADIOISÓTOPOS
Fluoresceina, Umbeliferonas, Rodamina, Quelatos
de tierras raras
FLUORÓFOROS
Fosfatasa alcalina Peroxidasa
ENZIMAS
Luminol y derivados Luciferasa/luciferina
QUIMIOLUMINISCENTES
PARTÍCULAS
Latex, Células rojas
IONES METÁLICOS
Au3
Cofactores enzimáticos (FAD) Sustratos
enzimáticos Proteinas Ionóforos
OTROS
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CLASIFICACIÓN DE TÉCNICAS DE SEPARACIÓN Ag libre
/ Ag combinado
Principio
Técnica
Carga Tamaño molecular
ELECTROFORESIS CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL
Características físico- químicas de Ag y Ac
Empleo de carbón activo recubierto (enlaza la
fracción libre)
ADSORCIÓN
Sulfato sódico o amónico (? 200 g/l) Efecto
salino Polietilenglicol (? 200 g/l)
PRECIPITACIÓN
INMUNOLÓGICO
En fase líquida
DOBLE ANTICUERPO
Ag o Ac inmovilizado en fase sólida (tubo,
placa, bolitas etc.)
En fase sólida
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INMUNOENSAYO COMPETITIVO
MUESTRA (Ag)


ANTÍGENO MARCADO
ANTICUERPO (Reactivo limitante)
?
B
FRACCIÓN ENLAZADA (B)
Ag
CURVA DOSIS- RESPUESTA
FRACCIÓN LIBRE
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INMUNOENSAYO COMPETITIVO
Ac(s) Ag(L) AgAc
inicial
N T
equilibrio
N-B-B F B
Ac(s) Ag(L) AgAc
inicial
N T
equilibrio
N-B-B F B
B/F B/F B/T B/T
Si K K
CURVA DOSIS-RESPUESTA
K muy alta Ac saturado, N BB
Ecuación de hipérbola
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INMUNOENSAYO NO COMPETITIVO
ENSAYO INMUNOMÉTRICO DE DOS SITIOS (TIPO
SANDWICH)
MUESTRA (Ag)

ANTICUERPO INDICADOR (marcado)

1º ANTICUERPO (EXCESO)
?
FRACCIÓN ENLAZADA (B)
CURVA DOSIS-RESPUESTA
FRACCIÓN LIBRE
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INMUNOENSAYOS CON RADIOISÓTOPOS COMO MARCADORES
Internas (14C, 3H)
MARCADORES ISOTÓPICOS
Externas (125I)
1. Métodos de oxidación
2. Métodos de conjugación
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INMUNOENSAYOS CON RADIOISÓTOPOS COMO MARCADORES
RIA (Radioimmunoassay) (Radioinmunoensayo directo)
Incubación
Lavado
Patrones o muestra
Reactivo limitante
Ag
Recuento
EMPLEO DE TRAZADOR UNIVERSAL
Patrones o muestras
Proteina A


Incubación
lavado
Ag inmovilizado
Anticuerpo (limitante)
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INMUNOENSAYOS CON RADIOISÓTOPOS COMO MARCADORES
IRMA (Immunoradiometric Assay) ENSAYOS
RADIOINMUNOMÉTRICOS
IRMA (ensayo de inhibición)


Incubación
lavado
Anticuerpo (limitante)
Ag inmovilizado
IRMA (no competitivo)


Patrones o muestras
Ac
Ac Exceso
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ENZIMOINMUNOENSAYOS
Características de las enzimas empleadas como
marcadores

• Elevada actividad específica. Cantidades muy
• pequeñas en líquidos biológicos.
• Reactivos comerciales de elevada pureza y bajo
  coste.
• Estables en amplio intervalo de condiciones de
  ensayo.
• Con grupos funcionales adecuados para su unión
• a anticuerpo o antígeno.
• Con sustrato estable y producto de fácil
  detección.

• Ensayos heterogéneos ELISA
• La unión antígeno-anticuerpo puede modular la
• actividad de la marca enzimática
• Ensayos homogéneos EMIT.

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ENZIMOINMUNOENSAYOS
Enzimas más empleadas como marcadores
Generación de la señal a. Colorimétrica H2O2
DH2 HRP 2 H2O D b.
Fluorimétrica c. Quimioluminiscente d.
Electroquímica (potenciométrica, voltamétrica
o amperométrica)
4-metilumbelife- AP 4-metilumbeliferona
fosfato rilfosfato
H2O2 luminol HRP H2O N2
3-aminoftalato
3-aminoftalato h?
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ENZIMOINMUNOENSAYOS HETEROGÉNEOS ELISA (Enzyme
Linked ImmunoSorbent Assay)
1. ELISA INMUNOMÉTRICO
a. Tipo Sandwich (medida de antígeno)
Ag de patrones o muestras ( )
Ac inmovilizado sobre fase sólida (Exceso)
Enzima
Ac indicador ( ) marcado con Enzima
(exceso)
1.Decantar y lavar
S
2. sustrato de la enzima (S)
P
S
P
P
S
Medida del producto de la reacción enzimática (
P)
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ENZIMOINMUNOENSAYOS HETEROGÉNEOS ELISA (Enzyme
Linked ImmunoSorbent Assay)
1. ELISA INMUNOMÉTRICO
b. Tipo Sandwich (medida de anticuerpo)
patrones o muestras con el Ac ( )
Ag inmovilizado sobre fase sólida (Exceso)
1. Decantar y lavar
Enzima
2. AntiIgG marcado ( ) (exceso)
1.Decantar y lavar
2. sustrato de la enzima (S)
P
Medida del producto de la reacción enzimática (
P)
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ENZIMOINMUNOENSAYOS HETEROGÉNEOS ELISA (Enzyme
Linked ImmunoSorbent Assay)
1. ELISA INMUNOMÉTRICO
c. ELISA DE CAPTURA (medida de anticuerpo)
patrones o muestras con el Ac ( )
Anti-IgG inmovilizado sobre fase sólida (Exceso)
1. Decantación y lavado
Enzima
2. Ag ( ) (exceso)
1.Decantar y lavar
2.Ac indicador ( ) marcado con enzima
(exceso)
3. Medida del producto de la reacción enzimática
( P)
-16-
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ENZIMOINMUNOENSAYOS HETEROGÉNEOS ELISA (Enzyme
Linked ImmunoSorbent Assay)
2. ELISA COMPETITIVO
Adecuado para analitos con MW lt 10000
1. Incubación
patrones o muestras con Ag soluble ( )
Ac marcado ( ) (reactivo limitante)
Ag inmovilizado (Ej. Digoxina)
2. Separación (decantación y lavado)
3. Medida de la actividad de la enzima unida al
soporte
Sustratos de la enzima
urea H2O
NH3 CO2
Señal
Ag
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ENZIMOINMUNOENSAYOS HOMOGÉNEOS EMIT (Enzyme
Multiplied Immunoassay)
Ensayo para la medida de HAPTENOS (hormonas,
medicamentos o drogas)
FUNDAMENTO
Desactivación del enzima utilizado como marcador
del hapteno, al unirse este al anticuerpo
correspondiente.

Hapteno
Hapteno unido al enzima
Anticuerpo Anti-hapteno
Complejo Antigénicp
Enzima inactivo
Enzima activo

sustrato

producto
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ENZIMOINMUNOENSAYOS HOMOGÉNEOS EMIT (Enzyme
Multiplied Immunoassay)
FORMATO DE ENSAYO (ensayo competitivo,
homogéneo)
1. Incubación
Ag



Ac (Reactivo limitante)


Patrones o Muestras

2. Adición del sustrato de la enzima
sustrato
Sólo la enzima unida a hapteno libre es activa
P
3. Medida del Producto de la reacción
enzimática
Hapteno
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FLUOROINMUNOENSAYOS
Propiedades que idealmente debería reunir un
fluoróforo para ser utilizado como marcador
? Estable y soluble en disolución acuosa ?
Elevado rendimiento cuántico ? ?excitación y
?emisión diferentes a las de la matriz de la
muestra ? Elevado desplazamiento de Stokes ? No
debe interferir en la reacción inmunológica
La unión antígeno-anticuerpo puede alterar las
propiedades espectrales del marcador ENSAYOS
HOMOGÉNEOS
? Inmunoensayo de Polarización de Fluorescencia
(FPIA)
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MARCADORES FLUORESCENTES EMPLEADOS EN
INMUNOENSAYOS
Marcador ?ex./nm
?em./nm ?/ns
Isotiocianato de fluoresceina (FITC)
492
516-525
4.5
Derivado diclorotriazínico de aminofluoresceina
(DTAF)
492
516-525
4.5
Umbeliferona (U)
325
465
4-metil-U
325
450
Tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC)
535-545
570-580
1-3
Rodamina-B isotiocianato (RBITC)
545-560
585
3
U
FITC
DTAF
4-metil-U
TRITC
RBITC
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23
Polarización de la emisión de fluorescencia
Monocromador
Fuente
Polarizador
I
90º
I?
I
Detector
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24
INMUNOENSAYO DE POLARIZACÍÓN DE FLUORESCENCIA
(FPIA)
Ecuación de Perrin
Siendo ? tiempo de vida de estado excitado
? tiempo de relajación rotacional. que
para una molécula esférica es
Ag (rápido movimiento rotacional, baja
polarización)
ENSAYO COMPETITIVO HOMOGÉNEO

Patrones o muestra (Ag)
Ac Reactivo limitante
Ag
p disminuye
p máximo
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25
FLUORESCENCIA DE TIEMPO RESUELTO
PROPIEDADES FLUORESCENTES DE ALGUNOS QUELATOS DE
LANTÁNIDOS
Excitación
IF
Nuevo Ciclo
Fluorescencia de fondo
MEDIDA
?
t
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FLUOROINMUNOENSAYOS HETEROGÉNEOS DE TIEMPO
RESUELTO (TRFIA)
? SISTEMA DELFIA (Dissociation Enhanced
Lanthanide Fluorescence Immunoassay)
Determinación del Eu unido a inmunorreactivos
después de su extracción con una disolución
intensificadora
? SISTEMA FIAgen
Empleo de exceso de Eu para cuantificar los
ligandos formadores de complejos fluorescentes
unidos a los inmunorreactivos
SISTEMA DELFIA
Disolución intensificadora
? pH 3.2 -- Disociación de complejos Eu-ácido
poliaminocarboxílico ? 2-naftoiltrifluoroacetona
(NTA)-- Forma con el Eu un quelato muy
fluorescente ? Oxido de trioctilfosfina ?
Triton X-100
aislan el complejo,protegiéndolo de la
desactivación por moléculas de agua
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27
SISTEMA DELFIA (Ver Otro Fichero)
28
SISTEMA FIAgen
Eu
Eu
Eu
Eu
Eu
Eu
Eu
Eu
Eu
Unión a la proteina
Unión al Eu3
Ácido 4,7-bis(clorosulfofenil)-1,10- fenantrolina-
2,9-dicarboxílico (BCPDA)
SATG(BCPDA)160
ENSAYO NO COMPETITIVO (SANDWICH)
analito
analito
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29
SISTEMA FIAgen
ENSAYO COMPETITIVO
Proteina portadora
Proteina portadora
Proteina portadora
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APLICACIONES ANALÍTICAS
? Análisis Clínico ? Análisis medioambiental
J. Van Emon, V. López-Ávila Anal. Chem. 64
(1992) 79 A ? Análisis de alimentos U.
Bilitewski Anal. Chem. 72 (2000) 692 A
INMUNOENSAYOS CON RADIOISÓTOPOS Potencialmente
aplicables a la determinación de cualquier
sustancia presente en un medio biológico con
elevada precisión y sensibilidad. RIA L.D.
10-14 M (generalmente 10-12 M) IRMA L.D. 10-16 M
(generalmente 10-14 M)
FLUOROINMUNOENSAYOS
Compiten con los anteriores
FPIA (para haptenos) Abbott AxSYM, TDx TRFIA
AutoDELFIA (Wallac)
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Aplicaciones de Inmunoensayos enzimáticos
? Análisis Clínico ? Análisis medioambiental ?
Análisis de alimentos
Enzimoinmunoensayos para antibióticos en alimentos

• Antibiótico
• ? Lactaminas
• Penicilina G
• Ampicilina
• Sulfamidas
• sulfadimetoxina
• sulfametazina
• sulfadiazina
• sulfamerazina
• cloranfenicol
• Aminosidos
• streptomicina
• gentamicina
• Macrolidos
• spiramicina
• lincomicina
• Otros
• Bacitracina

Límite de detección 5-10 ppb 5-10
ppb 50 ppb 10 ppb 50 ppb 40 ppb
0,5 ppb 10 ppb 50 ppb 50 ppb 50
ppb 50 ppb
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