LA RECHERCHE DE SIMILITUDES ENTRE SEQUENCES

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LA RECHERCHE DE SIMILITUDES ENTRE SEQUENCES

• T. AL ANI
• Laboratoire A2SI - Groupe ESIEE

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1. Introduction

• Le terme "génome" a été introduit en 1920 par
  Hans Winkler pour désigner l'ensemble (haploïde)
  des gènes d'un organisme. La nature du gène était
  alors inconnue. Ce n'est que dans les années
  1940-1960, que l'on a pu déterminer que le
  matériel génétique est constitué d'ADN ou d'ARN
  pour certains virus, et que l'on a découvert
  comment la succession des bases (la séquence)
  permet de coder une protéine. Nous sommes ainsi
  passés d'une définition théorique du génome
  (ensemble des gènes) à une définition physique
  le génome est constitué de molécules d'ADN.

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Introduction (suite)

• Chez les bactéries, ces deux définitions
  concordent le génome d'Escherichia coli, est
  formé d'une molécule d'ADN circulaire dans
  laquelle les gènes sont pratiquement accolés les
  uns aux autres.
• Par contre, chez de nombreux eucaryotes et en
  particulier chez les vertébrés, le génome ne se
  limite pas à l'ensemble des gènes. Bien au
  contraire, les gènes ne constituent qu'une faible
  portion du génome.

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Introduction (suite)

• Ainsi, alors que la fonction primordiale du
  génome est de servir de support de l'information
  génétique, une fraction importante du génome ne
  contient apparemment aucune information.

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Introduction (suite)

• Différentes hypothèses ont été proposées pour
  expliquer cette situation paradoxale.
• Certains auteurs pensent que l'ADN non génique
  est inutile et s'accumule dans le génome
  simplement parce qu'il n'est pas nuisible à
  l'individu.
• D'autres considèrent au contraire que la vaste
  majorité de l'ADN participe à l'organisation du
  génome, système complexe et ordonné qui intègre
  de multiples fonctions.

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Introduction (suite)

• Cette question n'est pas encore tranchée. Ce qui
  est clair, c'est que pour comprendre le génome
  des vertébrés, il est nécessaire d'en étudier les
  65 à 99,9 qui sont constitués de séquences
  non-codantes.

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Introduction (suite)

• La compréhension du génome implique à la fois une
  étude fonctionnelle, structurale et évolutive.
• L'étude fonctionnelle vise à identifier les
  différentes informations génétiques contenues
  dans le génome.
• L'étude structurale a pour objet de connaître les
  différents niveaux d'organisation du génome et
  d'essayer de comprendre comment cette
  organisation est en lien avec la fonction du
  génome.
• L'étude évolutive s'impose car pour comprendre le
  génome actuel, il est nécessaire de connaître les
  forces évolutives qui l'ont façonné.

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Introduction (suite)

• Même si le génome des vertébrés reste à bien des
  égards méconnu, des connaissances importantes se
  sont accumulées et une vision globale du génome
  commence à émerger.

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Introduction (suite)

• Lacide désoxyribonucléique (ADN) est le support
  de l'information génétique de tous les organismes
  vivants autonomes.
• Chez les eucaryotes, cette information génétique
  est contenue dans le noyau cellulaire, délimité
  par une membrane, ainsi que, pour une plus faible
  part, dans les organites cytoplasmiques
  (mitochondries, chloroplastes).

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Introduction (suite)

• Le génome nucléaire est fragmenté en plusieurs
  molécules linéaires d'ADN, qui constituent les
  chromosomes. La taille du génome correspond au
  nombre de paires de bases contenues dans les
  chromosomes d'une cellule haploïde. La taille du
  génome est généralement constante pour une
  espèce(d'où la "valeur C" pour la désigner).

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Introduction (suite)

• Le génome a pour fonction première de contenir
  l'information génétique nécessaire au
  développement, à la survie et à la reproduction
  de l'organisme. Nous nous attendons donc à ce que
  la taille du génome soit proportionnelle à la
  complexité de l'organisme. Or nous savons depuis
  plus de 40 ans Mirsky et Ris 1951 que la taille
  des génomes n'est pas en relation directe avec la
  complexité d'un organisme, ni avec le nombre de
  ses gènes (paradoxe de la valeur C).
• Mirsky A.E. Ris H. (1951) The DNA content of
  animal cells and its evolutionary significance.
  J. Gen. Physiol. 34451-462

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Introduction (suite)

• Contrairement à la taille des génomes, le nombre
  de gènes codant pour des protéines semble être
  corrélé (grossièrement) avec le degré de
  complexité de l'organisme Cavalier-Smith 1985.
• Cavallier-Smith T. (1985) Eukaryote gene
  numbers, non-coding DNA and genome size. In The
  evolution of genome size. Cavallier-Smith T (ed)
  ,Wiley, London, pp. 69-103

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Introduction (suite)

• Pour progresser dans la compréhension du génome
  des vertébrés, il faut essayer d'avoir une vision
  globale de son fonctionnement, de son
  organisation et de son évolution. L'objectif de
  ce chapitre est de faire un survol des différents
  points de vue que l'on peut avoir sur le génome
  des vertébrés
• compartimentation fonctionnelle quelles sont les
  informations génétiques contenues dans le génome?

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Introduction (suite)

• organisation structurale. La structure physique
  du génome peut être décrite sous plusieurs
  aspects organisation en classes de séquences
  répétées, structure de la chromatine, bandes
  chromosomiques, isochores. Quels sont les liens
  entre ces différents niveaux d'organisation?
• évolution, relations structure-fonction Quelle
  est l'origine évolutive de l'organisation
  physique du génome? Quelles sont les relations
  entre cette organisation physique et le
  fonctionnement du génome?
• composition nucléotidique homogène

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Introduction (suite)

• COMPARTIMENTATION FONCTIONNELLE
• Le premier point important pour comprendre
  l'organisation du génome est d'identifier les
  informations génétiques qu'il contient. En
  génétique moléculaire, un gène est
  traditionnellement défini physiquement, comme une
  région d'ADN qui code pour une protéine ou qui
  spécifie un ARN fonctionnel. Cependant, une
  région d'ADN peut avoir une fonction qui ne
  requiert ni sa traduction ni même sa
  transcription.

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Introduction (suite)

• Cavalier-Smith (1985) propose donc de définir le
  gène simplement comme un fragment d'ADN qui a une
  fonction connue. On peut reconnaître trois types
  de gènes
• les gènes protéiques, qui sont transcrits en ARN
  puis traduits en protéine
• les gènes spécifiant des ARN, qui sont
  transcrits mais non traduits
• les gènes régulateurs, dont la fonction ne
  requiert pas la transcription.

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Introduction (suite)

• Les gènes protéiques et les gènes spécifiant des
  ARN sont regroupés sous le terme de gènes
  structuraux.
• La classe des gènes régulateurs comprend tous les
  éléments fonctionnels du génome qui ne sont pas
  des gènes structuraux (centromères, télomères,
  origines de réplication, etc.). Cette définition
  est volontairement floue, pour souligner le fait
  que les éléments fonctionnels du génome n'ont
  probablement pas encore été tous découverts.

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Introduction (suite)

• COMPARTIMENTATION STRUCTURALE
• La structure physique du génome peut être
  décrites sous différents aspects, qui révèlent
  différents types de compartimentation
• organisation en classes de séquences répétées et
  uniques
• organisation en bandes chromosomiques, liée à la
  structure de la chromatine
• organisation en domaines de composition
  nucléotidique homogène (isochores)
• Il existe des relations entre ces différents
  niveaux d'organisation, ainsi qu'entre
  compartimentation physique et compartimentation
  fonctionnelle du génome.

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Introduction (suite)

• CORRELATIONS FONCTIONNELLES ET STRUCTURALES
• La compartimentation des chromosomes en bandes
  et en isochores est corrélée avec différents
  aspects du fonctionnement du génome.

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Introduction (suite)

• L'analyse statistique des séquences biologiques
  est une approche puissante pour étudier la
  structure, le fonctionnement et l'évolution des
  génomes.
• Les travaux de Grantham (1972) sur l'usage du
  code marquent sans doute le point de départ de
  cette nouvelle discipline. Depuis, les techniques
  de la biologie moléculaire ont très rapidement
  progressé et se sont diffusées dans de nombreux
  champs d'investigations de la recherche
  biologique et médicale.
• Grantham R. (1972) Codon base randomness and
  composition drift in coliphage. Nature New Biol.
  237265-266

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• 2. Recherche de similitude
• Permet de révéler des régions proches dans leur
  séquence primaire en se basant sur le principe de
  parcimonie en considérant le minimum de
  changements en insertion, suppression, ou
  substitution qui séparent deux séquences.
• Apprendre ainsi, par association, des
  informations importantes sur la structure, la
  fonction ou l évolution des biomolécules.

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Recherche de similitude (suite)

• Utilisation
• les recherches de motifs à travers une séquence,
• la caractérisation de régions communes ou
  similaires entre deux ou plusieurs séquences,
• la comparaison d'une séquence avec l'ensemble ou
  sous-ensemble des séquences d'une base de
  données,
• l'établissement d'un alignement multiple sur
  lequel sont basées les analyses d'évolution
  moléculaire.
• Nous décrirons dans ce cours les principes
  fondamentaux qui sont indispensables à la
  compréhension de ces outils.

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Recherche de similitude (suite)

• RECHERCHE PAR SIMILITUDE DANS LES BANQUES DE
  SÉQUENCES
• Le problème qui est donc posé est le suivant
  connaissant un gène ou une protéine, quelles sont
  les séquences de la banque de données qui lui
  sont similaires?
• La ressemblance que l'on cherche à détecter ne
  couvre pas forcément la séquence entière il est
  fréquent que les similitudes entre deux protéines
  ne portent que sur de courtes régions,
  correspondant par exemple à des motifs
  structuraux ou à des sites actifs.

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Recherche de similitude (suite)

• Le problème revient donc à rechercher des
  similitudes locales entre la séquence 'requête'
  et les séquences de la banque.

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Recherche de similitude (suite)

• Il existe de nombreuses méthodes de recherche de
  similitude, et leur efficacité peut être évaluée
  suivant plusieurs critères
• pertinence (capacité à détecter des similitudes
  reflétant des relations évolutives,
  fonctionnelles ou structurales entre les
  séquences)
• sensibilité (capacité à détecter toutes les
  similitudes pertinentes)
• sélectivité (capacité à discriminer les
  similitudes significatives du bruit de fond)
• rapidité

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Recherche de similitude (suite)

• De nombreux paramètres influent fortement sur
  l'efficacité de la recherche
• choix de la mesure de similitude
• choix de l'algorithme de recherche
• choix de la stratégie de recherche (protéique ou
  nucléique, traitement du bruit de fond dû à la
  redondance ou aux séquences répétées)
• complétude de la banque de données

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Recherche de similitude (suite)

• 2. 2. Mesure de similitude
• Quel que soit l'algorithme utilisé, le résultat
  de la recherche dépend fortement de la mesure de
  similitude qui a été choisie. Pour quantifier la
  similitude entre deux séquences, celles-ci sont
  alignées, c'est-à-dire juxtaposées de manière à
  mettre en regard les résidus que l'on juge
  correspondre.

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Recherche de similitude (suite)

• Par exemple l'alignement
• P I V S T Y A W R
• P I L S T - A W R
• indique que l'on suppose qu'il y a eu au cours
  de l'évolution substitution entre les résidus
  valine (V) et leucine (L), et qu'un résidu
  tyrosine (Y) a été inséré dans la première
  séquence ou délété dans la deuxième (NB on
  utilise généralement le terme "indel" pour
  indiquer un évènement d'insertion ou de délétion)
  .

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Recherche de similitude (suite)

• LES SYSTEMES DE SCORES
• Les principes de la détermination d'un score
• Objectif Qualifier et quantifier la similitude
  entre séquences.
• La similitude entre deux séquences est mesurée
  en sommant le long de l'alignement, les scores
  attribués à chaque paire de résidus et aux
  indels. Le choix des scores associés aux
  identités, substitutions et aux indels détermine
  donc la signification biologique de la similitude
  que l'on mesure.

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SCORE ELEMENTAIRE
Recherche de similitude (suite)

• Ceci est un élément d une matrice de scores qui
  rend compte de tous les états possibles en
  fonction de l alphabet utilisé dans la
  description des séquences. Ainsi, pour les acides
  nucléiques, la matrice d'identité ou unitaire est
  principalement employée. Elle rend compte de
  l'identité des résidus pour chacune des positions
  de la comparaison, on parle ainsi de bon ou de
  mauvais appariement ou bien de bonne ou mauvaise
  association.

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Recherche de similitude (suite)

• Ce critère qui permet déjà d'établir des
  ressemblances ne suffit pas toujours pour révéler
  au mieux les similitudes entre séquences. Très
  rapidement, on s'est aperçu qu'une insertion ou
  une délétion d'une ou plusieurs bases pouvait
  améliorer le score d'une comparaison et ainsi
  faire davantage ressortir les zones identiques ou
  très proches.

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Recherche de similitude (suite)

• Ces brèches (en anglais gap) que l'on impose aux
  séquences sont évidemment pénalisantes dans le
  calcul du score.
• Si l'on considère que le score donne le
  rapprochement entre deux séquences, on peut
  résumer celui-ci par l'équation suivante
• (1)

où se est un score élémentaire et sp une pénalité
d'insertion ou de délétion.
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Recherche de similitude (suite)

• Deux remarques
• le score est fonction de la longueur de la zone
  de similitude que l'on considère, c'est à dire
  que plus la longueur est grande, plus le score
  est élevé.
• on peut nuancer le calcul en donnant plus ou
  moins d'importance aux pénalités et aux
  associations possibles entre résidus.
• Ainsi, le poids d'une insertion peut être plus
  ou moins fort par rapport à une mauvaise
  association.

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Recherche de similitude (suite)

• On voit déjà très bien ici que par le biais de
  ces deux éléments fondamentaux, on pourra
  privilégier une situation plutôt qu'une autre,
  c'est-à-dire avoir des comparaisons de séquences
  avec peu ou beaucoup d'insertions-délétions. On
  retrouvera bien sûr ce type d'éléments sous forme
  de paramètre dans les programmes de comparaison.

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LES MATRICES DE SUBSTITUTION
Recherche de similitude (suite)

• Le choix de la pondération dépend de la nature
  de la similitude que l'on veut mettre en
  évidence.
• La mesure de similitude la plus simple consiste
  à donner un score de zéro aux substitutions et un
  score de un aux identités. Cette méthode est
  cependant peu sensible car il existe différents
  degrés de similitude entre séquences.

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Exemple
Recherche de similitude (suite)

• D un point de vue physico-chimique, la valine
  est proche de l'alanine. En conséquence, la
  substitution d'une valine par une alanine ne
  perturbe généralement pas le fonctionnement de la
  protéine. De telles substitutions sont dites
  conservatrices et sont relativement fréquentes au
  cours de l'évolution car elles modifient peu le
  phénotype et offrent donc peu de prise à la
  sélection naturelle.

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LES MATRICES DE SUBSTITUTION
Recherche de similitude (suite)

• Matrices de substitutions nucléiques
• Pour les séquences nucléiques, il existe
  seulement 4 x 4 possibilités de substitution.
  Certaines substitutions sont cependant plus
  probables que d'autres en particulier, dans le
  génome des mammifères, les transitions sont
  généralement plus fréquentes que les
  transversions. Des matrices de substitution
  nucléiques ont été développées pour tenir compte
  de cette propriété
• States et al. 1991 Molecular sequence
  accuracy and the analysis of protein coding
  regions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
  885518-5522

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EXEMPLE
Recherche de similitude (suite)

• Matrices de substitutions nucléiques
• a Matrice unitaire
• A C G T
• A 1 0 0 0
• C 0 1 0 0
• G 0 0 1 0
• T 0 0 0 1
• 2 scores possibles 1 pour l identité, 0
  autrement

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EXEMPLE (SUITE)
Recherche de similitude (suite)

• b Matrice à 3 scores
• A C G T
• A 3 0 1 0
• C 0 3 0 1
• G 1 0 3 0
• T 0 1 0 3
• 3 scores possibles 3 pour l identité, 1 pour
  une transition et 0 pour une transversion.

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Recherche de similitude (suite)

• Matrices de substitutions protéiques
• Pour tenir compte des similitudes entre
  aminoacides, il est nécessaire de pondérer
  chacune des substitutions possibles. Ces
  pondérations forment une matrice de substitution
  20 x 20. Le choix de la pondération dépend de la
  nature de la similitude que l'on veut mettre en
  évidence.

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Recherche de similitude (suite)

• Matrices de substitutions protéiques (suite)
• Dans le cas le plus général, on recherche une
  similitude qui reflète des relations d'homologie
  entre les séquences (et par conséquent des
  relations fonctionnelles et structurales) et on
  utilise donc une matrice qui indique les
  probabilités de substitution d'un aminoacide par
  un autre au cours de l'évolution.

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Recherche de similitude (suite)

• Matrices de substitutions protéiques (suite)
• Choix des matrices de substitutions
• Comme nous l'avons dit précédemment, le choix de
  la matrice de substitution dépend de la nature de
  la similitude que l'on veut mettre en évidence.
  Dans le cas le plus général, on recherche une
  similitude qui reflète une homologie entre les
  séquences et on utilise donc une matrice qui
  correspond aux probabilités de substitution d'un
  aminoacide par un autre au cours de l'évolution.

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Recherche de similitude (suite)

• Matrices de substitutions protéiques (suite)
• Choix des matrices de substitutions (suite)
• Ces probabilités varient avec la distance
  évolutive qui sépare deux protéines la matrice
  de substitution utilisée pour aligner deux
  séquences doit donc être choisie en conséquence.
• La 'distance génétique' entre aminoacides est
  le nombre minimal de changements de nucléotides
  dans le codon pour convertir un résidu en un
  autre.
• La distance évolutive  sépare la protéine
  requête des séquences similaires présentes dans
  la banque. Cette distance n'est pas connue a
  priori.

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Recherche de similitude (suite)

• Matrices de substitutions protéiques (suite)
• Choix des matrices de substitutions (suite)
• Différentes approches ont été proposées pour
  établir de telles matrices. Les matrices BLOSUM
  (Block Substitution Matrices) Henikoff et
  Henikoff 1992 ont été créées à partir
  d'alignements locaux, sans indels correspondant
  aux régions les plus conservées des protéines.

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Recherche de similitude (suite)

• Matrices de substitutions protéiques (suite)
• Aucune extrapolation n'est nécessaire car ces
  matrices ont été calculées directement pour
  différentes distances évolutives. Plusieurs
  matrices BLOSUM (notées 45, 62 et 80) ont été
  générées qui diffèrent par le degré de similitude
  entre les séquences qui ont été alignées.

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Recherche de similitude (suite)

• Matrices de substitutions protéiques (suite)
• Ainsi, la matrice BLOSUM-45 a été construite
  avec des séquences faiblement similaires et est
  donc adaptée pour de grandes distances
  évolutives, tandis que BLOSUM-80 est plus adaptée
  à de faibles distances évolutives.

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Recherche de similitude (suite)

• La synthèse de toutes les études montre que
  l'évaluation des matrices est très liée aux
  méthodes d'expertise utilisées et que leur usage
  est fortement corrélé aux types d'algorithme et
  de paramètrage utilisés. En conclusion, il
  apparaît tout de même que les matrices plutôt
  basées sur les comparaisons de séquences (comme
  les BLOSUM, Henikoff et Henikoff, 1992) semblent
  donner plus souvent de meilleurs résultats.
  Ainsi, la dernière version d'Octobre 1995 du
  programme FASTA de recherche avec les banques
  propose par défaut la matrice BLOSUM50.
• Henikoff S. Henikoff J.G. (1993) Performance
  Evaluation of Amino Acid Substitution Matrices.
  Prot.Struct. Funct. Genet. 1749-61

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Rappel des génétiques classiques
Recherche de similitude (suite)

• Gènes et Phénotypes
• Gène une unité fonctionnelle de l héritage,
  qui correspond habituellement à un segment d ADN
  codant pour une seule protéine.
• Génome l ensemble entier de gènes d un
  organisme.
• Locus l emplacement du gène dans le
  génome
• allèles des formes possibles d un
  gène