Seente molekulaargeneetika

1
Seente molekulaargeneetika

• Heidi Tamm

2
(kott)seened mudelorganismidena

• Saccharomyces cerevisiae
• Aspergillus nidulans
• Schizosaccharomyces pombe
• Neurospora crassa

3
Saccharomyces cerevisiae kui mudelorganism

• Eukarüoot
• Lihtne kasvatada
• Väike genoom kergesti manipuleeritav
• Kasvab kiiresti
• Mutantide isoleerimise lihtsus
• Hästidefineeritud geneetiline süsteem
• Rekombinatsioon kõrge sagedusega

4
Saccharomyces cerevisiae kui mudelorganism

• Mitmekülgne DNA transformatsiooni süsteem
• Nii haploidne kui ka diploidne faas stabiilne
• Mittepatogeenne
• Metaboolsed ja regulatoorsed mehhanismid kõrgelt
  konserveerunud
• Inimeste haigustega seotud geenide ortoloogid
• ...

5
Pärm milliseid protsesse uuritakse?

• Geeniregulatsioon
• raku koostisosade biosüntees
• mRNA translatsioon
• valkude post-translatsiooniline modifitseerimine
• valkude sekreteerimine
• mitokondri biogenees
• võõrgeenide ekspressioon

6
Pärm mida uuritakse?

• Rakutsükli regulatsioon
• Signaaliülekande mehhanismid
• Kromosoomi struktuur
• DNA replikatsioon
• Genoomika

7
Neurospora ja Aspergillus

• Haploidne vegetatiivne faas ja haploidsed
  koniidid -
• seeneniidistiku fenotüübi järgi saame teha
  järeldused genotüübi kohta

8
Neurospora
9
Aspergillus
10
Neurospora ja Aspergillus

• Iga eoskott sisaldab 8 eost
• peale meioosi toimub mitoos
• 2n tuuma iga üksik DNA ahel läheb ühe eose tuuma
• võimaldab algse DNA detailset analüüsi
• isegi heterodupleksi erinevused tulevad välja
  (osaline erinevus kaksikheeliksi ahelates)

11
Seente transformatsioon

• Katsetatud paljudel seentel
• Head protokollid olemas üksikute jaoks
• Saccharomyces
• Aspergillus
• Neurospora
• Ustilago

12
Mida on vaja transformatsiooni läbiviimiseks?

• Vektor, milles meid huvitaval geenil on sobiv
  promootor ja terminaator
• Seenerakud peavad olema kompetentsed
• Selektsioonisüsteem
• (Protoplastidest tuleb regenereerida mütseel)

13
Võimalused transformatsiooniks

• Protoplast
• Terve raku töötlemine Ca2 ja Li ioonidega
• Elektroporatsioon
• Geenipüss (gene gun, particle bombardment)

14
YAC
15

• S. cerevisiae genoom sekveneeriti 1996
• Goffeau et al. 1996. Science 274 546
• esimene täielikult sekveneeritud eukarüootne
  genoom

16
Sekveneeritud seened

• Ascomycota
• Saccharomyces cerevisiae
• strain S288C 12
• Saccharomyces cerevisiae
• strain RM11-1a 12
• Saccharomyces pastorianus 26
• Candida guilliermondii 12
• Candida lusitaniae 16
• Candida tropicalis 30
• Candida glabrata 12
• Ashbya gossypii 9
• Debaryomyces hansenii 10
• Kluyveromyces lactis 11
• Pichia stipitis 15
• Yarrowia lipolytica 21
• Schizosaccharomyces pombe 14
• Aspergillus nidulans 31
• Aspergillus fumigatus 32
• Aspergillus oryzae 37

Mbp

• Magnaporthe grisea 40
• Neurospora crassa 43
• Stagonospora nodorum 37
• Trichoderma reesei 33
• Epichloë festucae 35
•  
• Basidiomycota
• Coprinus cinereus 38
• Cryptococcus neoformans 20
• Ustilago maydis 20
• Phanerochaete chrysosporium 35
•  
• Zygomycota
• Rhizopus oryzae 40
•  
• Microsporidia
• Encephalitozoon cuniculi 2.5
•  
• Dictyosteliomycota (Protozoa)

17
http//www.genomesonline.org

• Genomes online database (GOLD)

18
S. cerevisiae genoom

• 12.1 Mb
• 200 korda väiksem inimese genoomist
• 4 korda suurem E. coli genoomist
• 16 kromosoomi
• Kromosoomide suurused 250-2500 kb
• 6000 ORF-i
• Valke kodeerivad alad moodustavad 70 genoomist

19
S. cerevisiae genoom

• 3.8 ORF-e sisaldab introneid
• Järjestikku 120 rRNA geenide komplekti kordust
  (XII kromosoomis)
• 275 tRNA geeni

20
(No Transcript)
21
(No Transcript)
22
(No Transcript)
23
S. cerevisiae valke kodeerivad geenid
24
S. cerevisiae geeniproduktide jaotus vastavalt
bioloogilistele protsessidele
25
S. cerevisiae kromosomaalsete geenide nomenklatuur

• Gene symbol Definition
• ARG All wild-type alleles controlling arginine
  requirement
• ARG2 A locus or dominant allele
• arg2 A locus or recessive allele confering an
  arginine requirement
• arg2 Any arg2 allele confering an arginine
  requirement
• ARG2 The wild-type allele
• arg2-9 A specific allele or mutation
• Arg A strain not requiring arginine
• Arg A strain requiring arginine
• Arg2p The protein encoded by ARG2

26
S. cerevisiae mitokonder

• Mitokondris leiab aset suur hulk biokeemilisi
  reaktsioone
• Oksüdatiivse fosforüleerimise teel
  produtseeritakse ATP ja NAD
• Pärmid on fakultatiivsed anaeroobid, mis
  tähendab, et nad saavad hakkama ka ilma
  molekulaarse hapnikuta gt võivad elada ilma
  funktsionaalse hingamisahelata

27
Pärmi elu ilma hingamata

• Eeldab sobivat süsinikuallikat (suhkrud)
• ATP süntees glükolüüsi ja kääritamise käigus
• Rakud kasvavad aeglaselt, kolooniad on väikesed
• Kääritataval söötmel kasvab ka siis, kui mtDNA on
  mutantne või puudub üldse

28
Pärmi mitokondriaalne genoom

• Suurus 80 kb (inimesel 16.5 kb)
• Lineaarne!
• Ühes haploidses pärmirakus 50 mtDNA koopiat
• Kodeerib hingamisahela ensüüme
• Ülejäänud valgud kodeerib tuuma genoom
• Tsütoplasmaatiline pärilikkus

29
Pärmi mitokondriaalne genoom ehk ? faktor

• Metsiktüüpi pärmirakud (grande), mis hingavad
  normaalselt ja moodustavad suuri kolooniaid, on
  ?
• Petite mutandid ei ole võimelised hingama ja
  nad moodustavad fermenteeritaval söötmel väikesi
  kolooniaid
• ?0 rakkudel puudub mtDNA üldse
• ?- rakkudel esineb mtDNA, mis on moodustunud wt
  mitokondriaalse genoomi üksikutest fragmentidest,
  mis esinevad paljude kordustena

30
petite - mutandid

• Saab eristada, ristates neid wt rakkudega
• ?0 rakud annavad wt (grande) järglased
• keskmiselt supressiivsete ?- rakkude järglased on
  pooled grande ja pooled petite
• hüpersupressiivsete ?- (HS) rakkude järglased on
  peaaegu kõik petite

31
?- mtDNA

• Sisaldab wt mtDNA üksikuid fragmente, mis
  esinevad paljude kordustena
• HS ?- mutantidel on selliseks fragmendiks
  arvatavasti replikatsiooni alguskoht (ori)

32
Schizosaccharomyces pombe

• Genoomi suurus 13.8 Mb
• 3 kromosoomi
• Pooldub, mitte ei pungu
• Kasutatakse raku kasvamise ja jagunemise
  uurimiseks

33
Suguline paljunemine

• Et saada maksimaalset kasu, peaksid ühinevate
  rakkude tuumad olema nii erinevad kui võimalik
• Tsütoplasmad peaksid olema nii sarnased kui
  võimalik (et vältida geneetilist saastust)
• Vegetatiivne vs. seksuaalne kokkusobivus

34
Vegetatiivne kokkusobivus

• Heterokaarüonid tekivad vaid samasse vegetatiivse
  kokkusobivuse gruppi kuuluvate hüüfide vahel
• Kui hüüfid ei ole kokkusobivad, siis vahetult
  kontakteeruvad rakud surevad

35
Vegetatiivne kokkusobivus/sobimatus

• Liitumise kokkusobimatus (fusion incompatibility)
  - kokkusobivussüsteem määrab ära rakkude võime
  liituda. (hallitusseentel)
• Liitumisejärgne kokkusobimatus (post-fusion)
  määrab ära, kas koos tsütoplasmaga saavad
  migreeruda ka tuumad jm. organellid

36
Ristumissüsteemid (suguline sobivus)

• On määratud tuuma geenide poolt, mis takistavad
  kahe geneetiliselt identse mütseeli ristumist
• Heterotallism süsteem, kus on takistatud
  ristumine kahe identse gameedi vahel
• Homotallism kui miski ei takista identsete
  gameetide ristumist

37
Ristumissüsteemid unifaktoriaalne

• Kui on ainult kaks ristumistüüpi tüüp sõltub
  sellest, milline kahest alleelist on
  ristumistüübi lookuses.
• Kuna on vaid üks lookus, millest tüüp sõltub gt
  unifaktoriaalne kokkusobimatus.
• Edukalt ristuvad vaid rakud, millel on
  ristumistüübi lookuses erinevad alleelid.
• N. crassa, S. cerevisiae, Puccinia graminis

38
Ristumissüsteemid bifaktoriaalne

• Kaks omaette ristumistüübi lookust (A ja B).
• Bifaktoriaalne
• Edukaks ristumiseks on vaja erinevaid alleele
  mõlemas lookuses
• Populatsioonis palju erinevaid alleele kummagi
  lookuse kohta
• Paljudel kandseentel Coprinus cinereus,
  Schizophyllum commune

39
Coprinus cinereus
40
Schizophyllum commune
41
S. cerevisiae ristumistüübi faktorid

• 2 ristumistüüpi a ja a
• Ristumistüüp määratud
• peptiidhormoonide (feromonide) poolt
  (a- ja a-faktorid)
• feromonispetsiifiliste retseptorite poolt

42
Kuidas ristumistüübi faktorid toimivad?

• Feromon seostub vastastüüpi raku pinnal oleva
  retseptoriga. Selle sündmuse tagajärjed
• rakus algab aglutiniini tootmine, nii kleepuvad
  rakud kokku
• mõlema raku kasv peatub G1 faasis
• muutub rakuseina struktuur ja raku kuju

43

• a-tüüpi rakkudes produtseeritakse
• a-feromoni
• a-feromoni retseptorit
• ja vastupidi
• a ja a feromonide ja nende retseptorite geenid on
  olemas mõlema ristumistüübi genoomides

44
MAT lookus

• Lookuses on 2 geeni (a1 ja a2 või a1 ja a2)
• MATa1 represseerib a-feromoni retseptori ja
  a-feromoni sünteesi
• MATa2 funktsioon teadmata
• MATa1 aktiveerib a-feromoni retseptori ja
  a-feromoni sünteesi
• MATa2 represseerib a-feromoni retseptori ja
  a-feromoni sünteesi

45
Kui tuumad on ühinenud

• Diploidid on alati MAT lookuse suhtes
  heterosügootsed
• a1 ja a2 valgud moodustavad heterodimeeri, mis
  aktiveerib meioosi ja sporulatsiooni ja
  represseerib haploidsed funktsioonid

46
Et asi oleks tõeliselt segane...

• Pärmi haploidsed rakud saavad oma ristumistüüpi
  muuta
• Kontrollib geen HO (endonukleaas)
• Dominantse alleeli korral toimub see peale igat
  raku jagunemist

HML
MAT
HMR
47
N. crassa tetraadide analüüs

• Eoskotid kui korrastatud tetraadid - alleelide
  kombinatsioon eostes vastab meioosi I ja II
  jagunemisele
• meioos I - kahe (homoloogilise) kromosoomi
  lahknemine
• meioos II - kahe tütarkromatiidi lahknemine

48
Tetraadide analüüs

• Saab jälgida rekombinatsiooni toimumist ja
  kindlaks teha aheldatuse gruppe
• Kottseened sobivad geenide meiootiliseks
  kaardistamiseks
• Pärmil on eoskotis 4 eost, mis on ühe meioosi
  tulemus
• Mitme alleeliga geenide aheldus
• Lookuse asukoht tsentromeeri suhtes

49
Tetraadide analüüs tänapäeval

• Et kindlaks teha mutatsiooni, mis vastab
  konkreetse lookuse muutmisele
• Et konstrueerida uusi tüvesid
• Et kindlaks teha geenide interaktsioone

50
Erinevad tetraaditüübid. Ristati AB ab Eri
tüüpide osakaal näitab, kas A ja B on aheldunud
51
Auksotroofid

• Auksotroofsed mutandid, kes pole ühe geeni
  muteerumise tõttu võimelised kasvama teatud
  söötmel
• Kasv taastus, kui söötmele lisati üks komponent

Esineb spetsiifiline sõltuvus konkreetse geeni
produkti ja metaboolse sammu vahel. Üks geen -
üks valk hüpotees
52

• Auksotroofne organism sisaldab mutatsiooni, mis
  muudab organismi toitumisvajadusi
• Prototroof metsiktüüpi organism muutmata
  toitumisvajadustega

53
Pärmi auksotroofsed markerid

• Aminohapped
• Leu
• His
• Trp
• Nukleotiidid
• Uratsiil
• Adeniin

54
Mis on komplementatsioon?

• Kahe auksotroofi ristamisel saadud diploid on
  prototroof, kui defektid on erinevates lookustes
• Alleel, mis ühes haploidis on mutantne
  (retsessiivne), on teises haploidis
  funktsionaalne (dominantne)
• Mõlema haploidi wt alleelid kompenseerivad teise
  haploidi defektse alleeli

55
Mis on komplementatsioon?

• Kui defektid on samades lookustes, siis kahe
  auksotroofi ristamisel tekkiv diploid on
  auksotroof
• Retsessiivne homosügoot
• Ka eri liikidelt pärit geenid võivad üksteist
  täiendada

56
Komplementatsiooni test

• Haploidsete auksotroofide genotüüpide
  kindlakstegemiseks
• Tundmatu genotüübiga haploid ristatakse
  teadaolevate genotüüpidega haploididega
• peavad olema erineva ristumistüübiga

57
Komplementatsioonigrupid

• Kui defektsete tüvede ristamisel ei toimu
  komplementatsiooni, kuuluvad nad samasse gruppi
• Iga grupp esindab ühte ensüümi biokeemilises
  rajas
• Suuremahulised projektid võimaldavad
  identifitseerida kõik kompl. grupid gt kõik
  geenid metaboolses rajas

58
Alati pole kõik nii ilus

• Kahe lookuse suhtes heterosügootne diploid võib
  fenotüübilt olla ikkagi defektne
• Alleelne ehk geenisisene komplementatsioon
  mutatsioonid on mõlemas tüves samas lookuses

59
Geenisisene komplementatsioon

• Kui ensüüm koosneb kahest või rohkemast identsest
  subühikust
• Kaks erinevalt defektset valku kompenseerivad
  teineteise vead
• Kui ensüüm koosneb erinevatest domäänidest, mis
  täidavad erinevaid katalüütilisi funktsioone
• Pärmis on tavaline

60
Kas siis ikkagi 1 või 2 lookust?

• Tetraadide analüüs
• Rekombinatsiooni sagedus
• väga madal gt mutatsioonid samas lookuses
• kuni 25 gt mutatsioonid erinevates lookustes

61
Genoomika

• Funktsionaalne genoomika
• Millised genoomi osad sisaldavad geene?
• Mida need kodeerivad?
• Võrdlev genoomika
• Lähedaste liikide genoomide võrdlemine

62
Pärm ja genoomiuuringud

• DNA kiipide kasutamine transkriptoomi uurimiseks
• Geeni funktsioonide analüüs geeni katkestamise
  teel
• Valkude lokalisatsiooni analüüs
• 2D protein maps
• Ensümaatilise aktiivsuse analüüs
• Valk-valk interaktsioonide analüüs

63
Pärmid ja proteoomika

• Geenijärjestuste analüüs vs. valkude analüüs
• Valgud ei tegutse tavaliselt üksinda
• Valgukomplekside analüüs

64
Pärmi proteoomi 2D-kaart
65
Kuidas analüüsida valk-valk interaktsioone?

• Pärmi kaksikhübriidsüsteem
• mRNA sünekspressioon
• Geneetilised interaktsioonid ehk sünteetiline
  letaalsus
• In silico meetodid
• Valgukomplekside afiinsuspuhastamine
  mass-spektromeetria

66
Pärmi kaksikhübriidsüsteem

• Transkriptsioonifaktor koosneb DNA-ga seonduvast
  domäänist ja aktivatsioonidomäänist
• Domäänid on eraldatud ja liidetud 2 uuritava
  ORF-iga
• Pärmis ekspresseeruvad liitvalgud

67
Afiinsuspuhastamine ja mass-spektromeetria

• Valkudele liidetakse peptiidne märgis
• Afiinsuskromatograafia
• Valk kui sööt terve kompleksi väljapuhastamiseks
• Identifitseerimine mass-spektromeetria abil

68
TAP tandem affinity purification
C-terminaalse TAP-märgise skeem. CBP
kalmoduliiniga seostuv peptiid, TEV TEV
proteaasi lõikesait, ProtA - Staphylococcus
aureus'e proteiin A