1. dia

1
Az izomdystrophiák molekuláris genetikai
vizsgálata
Pikó H., Balog J. Herczegfalvi Á., Mayer P.,
Mechler F., Horváth R., Karcagi V. Fodor József
Országos Közegészségügyi Központ Bethesda
Gyermekkórház, DEOE Neurológiai Klinika,
Hódmezovásárhelyi Kórház, Jahn-F. Dél-pesti Kórház
2
Izomdystrophiák

• Duchenne/Becker izomdystrophia (DMD/BMD)
• Facioscapulohumeralis izomdystrophia (FSHD)

3
Általános jellemzok, klinikai tünetek

• Elofordulási gyakoriság - DMD 13500, BMD
  130000
• X kromoszómához kötött recesszív öröklodésmenet
• A betegség kezdete 2 éves korra teheto,
  fokozatos progresszióval
• Az elhalálozás ideje 20-25 éves korban
• A Becker típus esetén enyhébbek a tünetek,
  nincs korai halál

4
A betegség genetikai háttere, pathomechanizmusa

• A dystrophin gén (Xp21) 2.5 Mb méretu, 79 exont
  tartalmaz és 14 kb méretu mRNS-t kódol
• A géntermék a dystrophin fehérje (427 kDa),
  amely sarcolemmális lokalizációt mutat a
  dystrophin- asszociált glycoprotein komplex
  részeként
• A DMD esetén a dystrophin teljes hiánya, BMD
  esetén csökkent mennyisége mutatható ki

5
A betegség kialakulásában szerepet játszó
géndefektusok

• Deléciók (60), hot-spot régiók a gén proximalis
  és distalis részén
• Duplikációk (5)
• Pontmutációk (35)
• Minden harmadik esetben új mutáció alakul ki
• A mutáció következményei (frame-shift hipotézis)
• in-frame mutáció - BMD fenotípus
• out of frame mutáció - DMD fenotípus

6
Molekuláris diagnosztikai vizsgálatok

• Multiplex PCR reakció 2 x 9 exon vizsgálata
  egyidejüleg
• Southern blot analízis cDNS próbákkal ( XJ10,
  7b8, 30.2, 30.1, 47.4, 60.1)
• Immunohistochemia
• Western blot technika fehérje analízis

7
Multiplex PCR deléciós analízis
8
Southern hibridizáció XJ10 cDNS próbával
(HindIII és BglII emésztés)
9
Eredmények

• Eddig 100 betegnél végeztük el a multiplex PCR
  analízist, amely alapján a betegek 57-ában
  deléciót mutattunk ki
• Négy esetben végeztünk prenatális vizsgálatot
• A feltételezett hordozó anyák és leánytestvérek
  (31 fo) cDNS vizsgálata során 18 esetben
  bizonyítottuk a hordozósági státuszt
• Az új módszerek bevezetése a DMD/BMD betegség
  molekuláris genetikai vizsgálatában lehetoséget
  biztosít az alábbi célok megvalósításához
• deléciók méretének pontos meghatározása
• de novo mutációs esetek azonosítása
• hordozósági státusz vizsgálata
• prenatális vizsgálatok felajánlása

10
Az FSHD molekuláris háttére (1.)

• Öröklodésmenete autoszómális domináns, de nem
  teljes penetranciával (95-os)
• A 4q és 10q kromoszómák szubtelomerikus
  régiójában található D4Z4 ismétlodo szekvenciák
• A betegekben a 4q35 régióban DNS átrendezodés
  történik, a D4Z4 szekvenciák száma csökken
• Eltéro restrikciós térkép
• - a 4q35 régióban csak egy D4Z4 tartalmaz BlnI
  hasítási helyet
• - a 10q26 régióban minden egyes D4Z4 tartalmaz
  BlnI hasítási helyet

11
Az FSHD molekuláris háttére (2.)

• A p13E-11 polimorf próba detektálja EcoRI
  emésztés után
• 4q35 38kb-300kb (egészséges), 10kb-38kb (beteg)
• 10q26 20kb-320kb
• Komplikáló tényezo szubtelomerikus
  kicserélodések a 4q35 és 10q26 régió között (a
  populáció 20-ában)
• - PFGE alkalmazása ill. dózis teszt
• EcoRI fragmentum mérete korrelál a betegség
  súlyosságával és a tünetek megjelenésének
  idopontjával
• De novo mutációk is? juvenilis formák

12
Southern analízis értékelése

• lt38kb BlnI rezisztens fragmentum
• FSHD

• lt38kb BlnI szenzitív fragmentum
• dózis teszt
• 10-es típusú
• repeatek túlsúlyban FSHD
• 4-es típusú nem FSHD
• repeatek túlsúlyban

13
Dózis analízis Southern hibridizációval
14
FSHD genotípus ikrekben
38 kb
8.5 kb
Súlyos, infantilis típus, de novo mutációval, 1
D4Z4 repeat elem maradt
4q35 p13E-11 próbával a betegek EcoRI
fragmentuma lt38 kb, BlnI rez.
15
FSHD molekuláris vizsgálataink eredményei
(2000.-2004.)
Család 38 Eredmény Tünet-mentes Beteg
Össz fo 78 pozitív - 32
Beteg 55 negatív 18 9
Tünet-mentes 23 folyamatban 5 14