MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR

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MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR

• CONSEJOS DE CAPTURA DE IMÁGENES DESDE EL
  MICROSCOPIO

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MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR

• INTRODUCCIÓN
• CONSIDERACIONES PREVIAS
• POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN
• AJUSTE KOHLER
• MALOS PROCEDIMIENTOS
• CAPTURA DE IMAGEN
• CONSEJOS

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MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR
INTRODUCCIÓN

• Para obtener unos buenos resultados en el
  análisis de imagen, es importantísimo partir de
  una buena adquisición de esa imagen.

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CONSIDERACIONES PREVIAS

• HACER BIEN LOS PROTOCOLOS DE FIJACIÓN, TINCIÓN .
• CANTIDAD DE CÉLULAS O TEJIDO SUFICIENTE PARA QUE
  NO FALLE NUESTRA OBSERVACIÓN
• SI VAMOS A CONTAR CELULAS EVITAR AGREGADOS
• PERO POCAS CELULAS SON POCO REPRESENTATIVAS
• MONTAJE CON MEDIO DE MONTAJE
• DURARÁ MÁS TIEMPO
• ETIQUETADO SABER QUE ES LO QUE SE HA PUESTO EN
  EL PORTAOBJETOS
• MUESTRAS DUPLICADAS SI SE PUEDE
• SABER EXACTAMENTE LO QUE BUSCAMOS

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CONSIDERACIONES PREVIAS

• USAR CONTROLES
• CASOS DE EMISIONES DE FLUORESCENCIAS PRÓXIMAS EN
  EL ESPECTRO
• COLOCALIZACIÓN
• USAR UN BUEN CUBRE
• PARA CONFOCAL 0,17 mm
• VER LA CALIDAD 1,5
• NO LLENAR EL PORTA DE MUESTRAS
• EN EL BORDE PUEDE CHOCAR LA PLATINA CON EL
  OBJETIVO
• NO APOYAR BIEN EL PORTA, SE PUEDE LEVANTAR,
  INCLINARSE
• NO PODER ENFOCAR BIEN
• VERIFICAR QUE TIENE ACEITE EL OBJETIVO, SI LO
  NECESITA

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CONSIDERACIONES PREVIAS

• SI SE VA A OBSERVAR CÉLULA VIVA
• PREPARACIÓN ANTICIPADA DE LA Tª Y CO2
• PREPARAR EL SISTEMA
• AL MENOS 1 HORA PARA LA Tª
• VERIFICAR EL CO2
• EN LA PLACA IDEALMENTE USAR MEDIO SIN ROJO
  FENOL,
• QUENCHING (DISMINUYE LA SEÑAL, AUMENTA EL FONDO)
• USAR UN POCILLO CON ROJO FENOL PARA CONTROLAR pH
• COMPROBAR QUE EL FLUOROCROMO AGUANTA LA LARGA
  DURACIÓN DEL EXPERIMENTO
• Si se va a excitar 200 veces en 24 horas,
  excitarlo 200 veces en 16 min.
• Mas vale perder 16 min. que 24 horas de
  observación.
• ASEGURARSE QUE TODO FUNCIONA BIEN, NO SE TIRAN 24
  HORAS.
• VERIFICAR QUE LA PLACA DEJA PASAR LA
  FLUORESCENCIA Y EN SU CASO LOS LÁSERES.

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POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN

• 1. Verificar que la iluminación sea la correcta.
• 2. Verificar que las lentes del objetivo estén
  limpias.
• 3. Comprobar que entre el diafragma de campo y el
  de abertura, no haya ningún filtro difusor.
• 4. El centrado del revólver portaobjetivos debe
  ser el correcto.
• 5. El portaobjetos y el cubreobjetos deben estar
  limpios. Comprobar que el primero esté bien
  colocado, y que no haya dos cubreobjetos
  superpuestos.
• 6. Verificar la limpieza de todo el sistema
  óptico. Esto se puede efectuar haciendo girar por
  separado los oculares que el microscopio posea,
  comprobando si las pequeñas motas de suciedad se
  mueven Si es así, es que hay que limpiar el
  ocular.
• Luego, habrá que hacer girar el tubo ocular en su
  conjunto éste no debe ser desmontado nunca, pero
  sí se pueden limpiar cuidadosamente los prismas
  soplando sobre las superficies accesibles. El
  objetivo puede limpiarse desenroscándolo
  ligeramente y ayudándose de un pincel seco.
• En la cámara de fotos Si al girarla, las manchas
  no se mueven, las partículas están en la cámara.
• CUIDADO PUEDE SER PEOR EL REMEDIO QUE LA
  ENFERMEDAD!!

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POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN

• 7. Comprobar que el aceite de inmersión sea el
  suficiente, sin burbujas ni impurezas, y que no
  sea fluorescente. Que no haya miserias ni
  derroches.
• Excesos ensucian y manchan objetivos, mesa,
  dedos, manos
• 8. Asegurarse de que el objetivo está bien
  enroscado.
• 9. Verificar el grosor del cubreobjetos,
  portaobjetos y medio de montaje, que es decisivo,
  sobre todo en medianos y grandes aumentos. Es
  importante, igualmente,
• NO COLOCAR DOS CUBREOBJETOS SUPERPUESTOS.
• 10. La montura del condensador debe estar bien
  centrada y la frontal bien sujeta, en el caso de
  que sea abatible. Comprobar que la cremallera
  esté bien apretada, para mantener la posición.
• 11. La intensidad lumínica no debe ser débil, ni
  excesiva.
• No hay que regularla nunca con el diafragma del
  condensador.
• 12. Tener cuidado de no utilizar objetivos de
  contraste de fases para observaciones de campo
  claro, sobre todo cuando trabajamos con grandes
  aumentos.

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POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN

• 13. Utilizar una combinación correcta entre el
  ocular y el objetivo, pues puede ocurrir que el
  ocular sea demasiado potente.
• 14. Comprobar que la preparación esté bien hecha,
  comparándola con una preparación test.
• 15. En contraste de fases, es común el error en
  el centrado del anillo de iluminación.
• Aunque éste puede descentrarse debido a la
  geometría de las estructuras.
• 16. En observaciones con fluorescencia, las
  fluorescencias parásitas que se pueden descubrir
  pueden ser debidas a el medio de montaje, al
  aceite de inmersión, una óptica inadecuada, el
  uso de un filtro incapaz de cortar los rayos de
  excitación.
• 17. Si el medio de montaje tiene un índice de
  refracción muy similar al del objeto incoloro,
  éste no podrá verse, ni con contraste de fases,
  ni con contraste interferencial.
• 18. Si se observa una neblina solamente en los
  bordes del campo, se deberá a una mala corrección
  de esfericidad del campo por parte del sistema
  óptico. Con objetivos caros es raro que ocurra.

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POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN

• 19. En DIC, comprobar que efectivamente está el
  prisma de corredera bien colocado. Con placas
  Petri de plástico, no se podrá manifestar el
  rendimiento óptico normal debido a la
  característica de polarización de la Placa Petri,
  con lo que se recomienda usar una de vidrio.
• 20. Si se va a hacer colocalización no deben de
  estar interpuestos ningún prisma en la
  trayectoria de la luz fluorescente, ya que los
  primas producen la difracción la luz.

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AJUSTE KÓHLER

• NECESARIO PARA UN BUEN ALINEAMIENTO DE LA LUZ
• AJUSTES PARA LUZ TRANSMITIDA-CAMPO CLARO SEGÚN
  KÓHLERPara la representación más fiel posible de
  un objeto juegan un papel muy importante, además
  de los llamados haces de luz directos, también
  los indirectos, es decir, los haces de luz
  difractados y dispersados en los detalles del
  preparado.
• Según ABBE vale Cuanto mayor es el factor de los
  haces de rayos indirectos (apertura), tanto más
  fiel al objeto será la representación
  microscópica.Para aprovechar el rendimiento
  óptico total del microscopio, en particular del
  objetivo, el condensador, el diafragma de campo
  luminoso y el diafragma de apertura deberían
  estar ajustados según el principio de iluminación
  de KÓHLER,
• PROCEDIMIENTO
• El microscopio debe estar conectado, con la
  lámpara halógena encendida.
• Regular la claridad de la imagen mediante el
  regulador de luz.
• Poner un preparado con contrastes fuertes en la
  platina de desplazamientos en cruz.
• Intercalar en caso dado la óptica frontal del
  condensador, se recomienda el objetivo de menor
  aumento y llevar el condensador mediante el mando
  para movimiento vertical hasta el tope superior.
  El tope tiene que estar ajustado de tal manera
  que el preparado no sea levantado por el
  condensador.
• Intercalar el objetivo 10x  mediante el revólver
  portaobjetivos y enfocar el preparado mediante el
  mando de enfoque.

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AJUSTE KOHLER

• Cerrar el diafragma de campo luminoso,  hasta que
  se pueda ver (aunque poco nítido) en el campo
  visual ,
• Bajar el condensador mediante el mando para
  movimiento vertical hasta que el borde del
  diafragma de campo luminoso aparezca con
  suficiente nitidez.
• Centrar la imagen del diafragma de campo luminoso
  mediante los dos tornillos de centrado situados
  en el portacondensador
• Abrir después el diafragma de campo luminoso
  hasta que su borde justamente desaparezca del
  campo visual .
• Para ajustar el diafragma de apertura (contraste)
  sacar un ocular del portaoculares y mirar a
  simple vista por el tubo- Ajustar el diafragma de
  apertura a unos .2/3 .,.4/5 del diámetro de las
  pupilas de salida de los objetivos. En la mayoría
  de las aplicaciones, este ajuste del diafragma.
  de apertura proporciona el mejor contraste con
  una resolución casi completa, y por lo tanto
  representa el compromiso más favorable para la
  vista humana.
• Volver a insertar el ocular en el portaoculares
• http//www.ipb.csic.es/servicios/Microscopia/ajust
  es-en-microscopios.html

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MALOS PROCEDIMIETOS BREVEMENTE
EVITARLOS, NO HACERLOS Y SOBRE TODO NO
REPETIRLOS Y AVERIGUAR PORQUE SALIÓ MAL
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BUENOS PROCEDIMIETOS

• UTILIZAR CONTROLES
• PROCEDIMIENTO
• USAR EL QUE TIENE SEÑAL Y AJUSTAR
• PONER EL CONTROL
• SI DA SEÑAL BAJARLO HASTA QUE DESAPAREZCA
• SI NO DA SEÑAL DEJARLO YA ESTÁ HECHO
• SI DIO SEÑAL EL CONTROL
• DESPUÉS DE AJUSTAR HASTA QUE DESAPAREZCA
• VOLVER A PONER LA MUESTRA PROBLEMA Y AJUSTAR
• SI NO SE HACE PENSAR SI LO QUE HACEMOS,
• LO ESTAMOS HACIENDO BIEN
• ES UN BUEN PROCEDIMIENTO?
• VALORACIÓN O TITULACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES DE
  LOS FLUOROCROMOS
• FACILITA UN AJUSTE ADECUADO DE NUESTRO CONTROL

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CAPTURA DE IMAGEN

• USAR EL BOTONCITO DEL SOFTWARE QUE NOS REFERENCIA
  EL NO SATURAR LAS IMÁGENES.
• CAPTURA DE IMAGEN UTILIZANDO
• EL MÁXIMO RANGO DE NIVELES DE GRISES
• SI SE SATURAN LAS IMÁGENES Y QUEREMOS CUANTIFICAR
  INTENSIDAD, NO PODRÁN VALORARSE
• COMPROBAR EN EL RECORRIDO DE Z QUE NO EXISTE
  SATURACIÓN
• SI NO SE COMPRUEBA ES COMO VOY A TENER SUERTE DE
  GOOGLE
• FOTOGRAFÍA OSCURA SE PODRÁ REALZAR
• FOTOGRAFÍA SATURADA

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CAPTURA DE IMAGEN

• DEFINICIONES
• BINNING
• El proceso de combinar la carga de varios pixeles
  adyacentes para crear superpixeles antes de la
  lectura.
• El Binning incrementa la velocidad de refresco y
  la proporción de señal-ruido de la cámara a
  cambio de una reducción en la resolución
  espacial. Es fundamental para enfocar en vivo
  en condiciones de baja luminosidad

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CAPTURA DE IMAGEN

• BLOOMING/SATURACIÓN
• La saturación se relaciona con la intensidad
  máxima de luz con la que un píxel puede
  enfrentarse. Si un píxel es pensado como un
  pocillo de fotoelectrones, la saturación ocurre
  cuando el pocillo está lleno. El Blooming ocurre
  cuando el pocillo comienza a desbordar y cobrar
  (cargar) extensiones en pixeles vecinos,
  causándolos saturación. El desbordamiento se
  resalta como una raya blanca o la gota alrededor
  de un punto brillante sobre la imagen.

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CONSEJOS

• NECESARIO UN BUEN ALINEAMIENTO DE LA LUZ
• SI TENEMOS LUZ PARÁSITA
• FOTOGRAFÍA EN BLANCO, SIN MUESTRA, PARA ELIMINAR
  LOS RUIDOS.
• UTILIZAR EL SOFTWARE PARA REFERENCIAR LA NO
  SATURACIÓN DE LAS IMÁGENES
• A LA HORA DE HACER Z-STACKS SABER DETERMINAR LA
  DISTANCIA IDEAL PARA EVITAR DESENGAÑOS
• PÍXELES ALARGADOS, VESÍCULAS CORTADAS
• NO SE OBTIENEN CUANTIFICACIONES ADECUADAS

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CONSEJOS

• SI EL FLUOROCROMO SE QUEMA CON FACILIDAD
• PLANTEARSE SI HACER LA IMAGEN CON MENOR
  RESOLUCIÓN
• HACER PRIMERO TODO EL STACKS DEL FLUOROCROMO QUE
  ANTES SE QUEMA
• NO PERDER EL TIEMPO BUSCANDO CÉLULAS CON LA
  FLUORESCENCIA SIN OBTENER IMÁGENES
• BAJAR LA POTENCIA DEL LASER SI ES NECESARIO Y
  TENER UN POCO DE RUIDO AUNQUE HAYA QUE TRATARLO
  LUEGO DESPUÉS
• PLANTEARSE SI EXISTE OTRO PARECIDO O SUSTITUIBLE
• USAR PROTECTORES DE FLUORESCENCIA

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SI TENÉIS ALGUNA DUDA PREGUNTARME MUCHAS GRACIAS