Dia 1

1
CAT
DNA-ANALYSE VIA FLOWCYTOMETRIE
APR. INGE THOELEN
U.Z. LEUVEN, 3 MEI 2005
2
WAT?

• Analyse DNA-inhoud
• DNA-aneuploïdie
• Diploïd 46 chromosomen
• Hyperdiploïd gt 46 chromosomen
• Hypodiploïd lt 46 chromosomen
• Maligne cellen numerische en structurele
  chromosomale aberranties
• DNA-analyse enkel numerische aberranties!
• ? fasen celcyclus G1, S, G2 ? S-fase fractie
  (tumor-proliferatie)

3
HOE?

• Staal beenmerg, bloed, weefselbiopten
• Isoleren en kleuren celkernen m.b.v. CycleTEST
  PLUS DNA reagens kit (BD)
• Lyseren RBC (RCLB, zelfbereid)
• Oplossing A detergent, trypsine
• Oplossing B trypsine inhibitor, RNase
• Oplossing C propidium jodide (intercalator)
• Vervolgens flowcytometrische analyse
  (FACSCalibur, BD)
• Auto-analyse resulterende DNA-histogram met
  ModFit LT software

4
PRINCIPE FLOWCYTOMETRIE
FACScalibur (BD)
Sheath fluid
Sample
Argon Laser
5
DNA FLOWCYTOMETRIE
PI
Fluorescentie detector
488 nm
620 nm
Amplifier
256
1
Multichannel pulse height analyser
6
DNA-HISTOGRAM
7
DNA-HISTOGRAM
De DNA-index (DI) is de ratio van de gemiddelde
relatieve DNA-inhoud van de G1-cellen van de
patiënt en de gemiddelde relatieve DNA-inhoud van
de diploïde G1-referentiecellen. Cellen met een
normaal diploïd karyotype hebben per definitie
een DI1.
8
ANALYTISCHE PERFORMANTIE

• events gt 10.000
• CV diploïde piek 3
• B.A.D. (debris/aggregaten) lt 20
• (Reduced Chi-Square (RCS) goodness of fit)
• 1,0 tot 3,0 goed
• 3,0 tot 5,0 matig
• gt 5,0 slecht

Prouts Neck DNA Cytometry Consensus Conference
guidelines, USA 1992 (Shankey et al., 1993)
9
WAAROM?

• Ploïdie-status blasten is prognostische indicator
  in acute lymfoblastische leukemie (ALL)
• DNA-index opgenomen in risico-classificatie
  criteria pediatrische ALL (lt 18 jaar)
• Behandeling verschillend naargelang risicogroep
• Kinderen met zeer laag risico op recidief minder
  intensieve en minder toxische therapieschemas
  zeer hoog risico-ALL aangepaste en aggresievere
  therapie

10
ACUTE LYMFOBLASTISCHE LEUKEMIE

• Systemische, neoplastische proliferatie van
  lymfoblasten
• /- 70 van de gevallen patiënten lt 17 jaar
• ALL meest voorkomende vorm van kanker bij
  kinderen /- kwart van de kankerdiagnoses
• Acute leukemie bij kinderen ALL/AML ? 51
• Genezingskans pediatrische patiënten 80
• Ongekende etiologie
• Bestraling
• Genetische factoren Down syndroom

11
ACUTE LYMFOBLASTISCHE LEUKEMIE

• Klinisch bloed cytopenieën (bleek, vermoeid,
  bloedingen, koorts, infecties), extramedullaire
  leukemische infiltraten (CNS, lymfadenopathie,
  hepatosplenomegalie)
• Origine blasten
• Precursor B-lymfocyten 85
• Precursor T-lymfocyten 15
• Classificatie morfologisch (FAB) L1, L2, L3
  (Burkitt)
• Classificatie immunofenotypisch (EORTC)
• Pro-B ALL, common B, pre-B, mature B
• Pro-T ALL, pre-T, cortical T (common-T), mature T

12
ACUTE LYMFOBLASTISCHE LEUKEMIE
Uit Immunofenotypering in de diagnostiek
Indicatiestellingen, uitvoering en
interpretatie, Hoofdstuk 8, Adriaansen J. et
al., 1994.
13
ACUTE LYMFOBLASTISCHE LEUKEMIE
FAB L1, common B-ALL
14
BEHANDELINGSSTRATEGIE

• Grondige evaluatie van risico op recidief
  voorkomen van over- of onderbehandeling
• Meeste pediatrische hemato-oncologische centra
  deelname aan klinische studies waardoor
  behandeling volgens gestandaardiseerde
  onderzoeksprotocols
• Geen uniform risico-classificatiesysteem
• Belangrijke risico-classificatie criteria
• Initieel WBC-aantal
• Leeftijd bij diagnose
• Cytogenetica en ploïdie
• Immunofenotype
• Respons op inductietherapie

15
RISICO STRATIFICATIE
16
EORTC PROTOCOL 58951
Dexamethasone vs prednisolone during induction
and maintenance therapy, prolonged vs
conventional duration of L-Asparaginase therapy
during consolidation and late intensification, in
ALL and NHL of childhood. A Randomised phase III.

• EORTC European Organisation for Research and
  Treatment of Cancer
• CLCG (EORTC Childrens Leukemia Cooperative Study
  Group) trial 58951 België, Frankrijk, Portugal
• Vier risicogroepen
• Very low risk (VLR)
• Average risk 1 (AR1)
• Average risk 2 (AR2)
• Very high risk (VHR)

17
VLR CRITERIA

• ALL of B-cell lineage
• WBC less than 10,000/mm3
• Must meet 1 of the following conditions
• DNA index greater than 1.16 and less than 1.50
  and chromosome number 51-66 or unknown
• DNA index not assessed and chromosome number
  51-66
• DNA index greater than 1.16 and less than 1.50
  and chromosome number is unknown
• Good response to prephase therapy
• Absence of t(922) or BCR/ABL, t(411)/MLL-AF4,
  or 11q23/MLL rearrangement
• No acute undifferentiated leukemia (AUL)
• No CNS or gonadal involvement
• Precursor B-lymphoblastic NHL stage I or II

18
AR CRITERIA

• Must meet 1 of the following criteria
• ALL with good response to prephase therapy who
  are neither VLR or very high risk (VHR)
• VLR ALL with CNS involvement (CSF positive or
  negative)
• Precursor B-lymphoblastic NHL stage III or IV
  without any VHR feature
• Precursor T-lymphoblastic NHL
• AR patients substratified in
• AR1 B-cell lineage ALL with WBC less than
  100,000/mm3
• Surreptitious or hemorrhagic CSF becoming
  negative at D4 of prephase therapy
• Precursor B-lymphoblastic NHL stage III or IV
• Precursor T-lymphoblastic NHL stage I or II
• AR2 B-cell lineage ALL with WBC at least
  100,000/mm3
• T-cell lineage ALL regardless of the WBC
• Overt or non-equivocal CNS involvement at D0 or
  any CSF involvement at D4
• Gonadal involvement
• Precursor T-lymphoblastic NHL stage III or IV
• Newborn Down syndrome patients with AR2 features
  are assigned to the AR1 group

19
VHR CRITERIA

• Must meet 1 of the following criteria
• ALL patients meeting 1 of the following
  conditions
• Poor response to prephase therapy (at least
  1,000/mm3 blasts in peripheral blood after
  completion of prephase therapy)
• t(922) or BCR/ABL
• t(411)/MLL-AF4
• 11q23/MLL rearrangement
• Near haploidy (no more than 34 chromosomes or DNA
  index less than 0.7)
• Hypodiploid (35-40 chromosomes or DNA index 0.7
  to 0.8)
• AUL
• For B lineage ALL failure to achieve complete
  response (CR) after completion of protocol IA
• For T lineage ALL failure to achieve CR or good
  partial response (GPR) after completion of
  protocol IA
• Minimal-residual disease (greater than 1,000
  blasts/100,000 mononuclear bone marrow cells) at
  evaluation of IA (day 35)
• NHL patients who failed to achieve CR or GPR
  after completion of protocol IA
• All VHR patients are eligible for stem cell
  transplantation except those whose sole VHR
  criterion is a poor response to prephase therapy
  and who have none of the following features
• T-cell immunophenotype
• Early B ALL (CD10 negative)
• WBC at least 100,000/mm3
• Newborn Down syndrome patients with VHR features
  are assigned to AR1 group

20
PLOÏDIE DISTRIBUTIE
UK, 1990-1997
UZ Leuven, 1998-2005
Harrison C.J., Blood Reviews, 2001.
21
DNA-analyse onder de loep. 1. Doen we het
goed? 2. Gaan we de analyse behouden?
22
AANVRAAGFREQUENTIE
23
CYTOGENETICA

• Cytogenetica complementaire versus alternatieve
  methode
• Karyotypering en FISH numerische én structurele
  chromosomale abnormaliteiten
• ALL lage mitose-index, lage kwaliteit van de
  metafasen ? karyotypering vaak bemoeilijkt
• Doch slechts 1x geen diagnose via karyotypering
  op een totaal van 82 stalen (1.2) door CME UZ
  Leuven
• FISH tevens uitgevoerd indien geen definitieve
  conclusie via karyotype
• Cytogenetische testen langere antwoordtijden (?
  DNA-analyse lt 2 dagen)
• Karyotypering /- 3 dagen
• FISH tot /- 1 maand

24
KARYOTYPERING
Hyperdiploïd karyotype 56, XY
Philadelphia chromosoom t(922)
25
RETROSPECTIEVE ANALYSE WAAROM?

• Zeer lage uitvoerfrequentie vervallen reagentia,
  matige expertise
• Geen adequate interne controle (normaal perifeer
  bloed ? PBMC)
• Geen interne kwaliteitscontrole met kippen
  erytrocyt nucleï (DNA QC Particles, BD)
• Geen kalibratie flowcytometer
• Geen controle lineariteit
• Geen controle resolutie

26
RETROSPECTIEVE ANALYSE

• Resultaten DNA-analyse vergelijken met de
  karyotypering
• Slechts 82 stalen tussen januari 1998 maart
  2005
• DNA-analyse praktisch altijd op beenmerg
  uitgevoerd, slechts in 2 gevallen op perifeer
  bloed
• Karyotypering (vermoedelijk) altijd op beenmerg

27
RESULTATEN

• 68 goede correlatie tussen DNA FCM en
  karyotypering
• Gebrekkige correlatie in 21 gevallen (26)
  altijd slechts 1-3 chromosomen afwijkend ? te
  lage resolutie FCM
• Look et al. (1985), Hiddemann et al. (1987),
  Perez-Vera et al. (2004) missen eveneens lage
  hyperdiploïdie/hoge hypodiploïdie met DNA FCM
• Deze gebrekkige correlatie echter geen invloed op
  risico stratificatie (gt 50 chromosomen VLR, 40
  chromosomen VHR)
• 5 (6) belangrijke discordanties DNA FCM ?
  karyotypering

28
DISCORDANTIES

• 3 gevallen met meerdere leukemische lijnen
  (patiënt 24, 48, 49)
• Leukemische lijn met laagste ploïdie arbitrair
  als primaire lijn
• Prognostisch minst gunstige lijn bepaalt het
  risico
• Risico diploïdie ? lage hyperdiploïdie ? near
  tetraploïdie gt risico hyperdiploïdie
• 1 geval (patiënt 47) met correcte analyse (DI
  1,14), echter foutief gerapporteerd
• 1 geval (patiënt 46) foutief geanalyseerd als
  diploïd (histogram toont schouder!)

29
DNA FCM VS CYTOGENETICA

• DNA-analyse na uitsluiten onoverkomelijke
  discordanties 1 foutieve interpretatie op een
  totaal van 82 stalen (1,2)
• Karyotypering 1x geen diagnose (1,2), FISH
  toont wel vermoeden van hyperdiploïdie
• Deze twee gevallen telkens toch toegewezen aan de
  very low risk-groep op basis van het
  cytogenetische respectievelijk het DNA-analyse
  resultaat

30
LINEARITEIT
31
LINEARITEIT
Cut-off voor gunstige hyperdiploïdie DI 1,16
of gt 50 chromosomen!
32
LINEARITEIT

• Look et al. (Blood, 1985)
• DI 1,16 geassocieerd met 53 chromosomen
• Uitzonderingen individuele chromosomen kunnen
  tot 4,5-voud variëren in DNA-inhoud
• Cut-off van 1,16 dient met de grootste
  voorzichtig-heid gehanteerd te worden
• Matige lineariteit van DNA FCM in ons
  laboratorium voornamelijk te wijten aan slechte
  lineariteit flowcytometer (immers geen controle!)

33
DIAGNOSTISCHE PERFORMANTIE

• DNA-index geen diagnostische maar prognostische
  waarde
• Diagnose van very low risk-patiënten (DI 1,16
  en gt 50 chromosomen)
• Vals negatief resultaat DI lt 1,16 en gt 50
  chromosomen ? sensitiviteit 17/24 71
• Vals positief resultaat DI 1,16 en lt 50
  chromosomen ? specificiteit 54/54 100
• Rekening gehouden met de matige lineariteit van
  de flowcytometer ? vals negatief resultaat in ons
  labo definiëren als DI 1 en gt 50 chromosomen ?
  sensitiviteit 23/24 96
• Sensitiviteit/specificiteit DNA-analyse moeilijk
  tot geen exacte cijfers terug te vinden in de
  literatuur
• Enkele onderzoeksgroepen (Hiddemann et al.,
  Perez-Vera et al.) sensitiviteit van 100
• Andere onderzoeksgroepen (Smets et al., Look et
  al.) near-100 retrieval van hyperdiploïdie
  d.m.v. DNA FCM

34
KOSTEN IMPACT

• Bij elke aanvraag analyse steeds op drie
  verschillende celsuspensies uitgevoerd
• Cellen patiënt
• Cellen patiënt normale controle
• Cellen normale controle
• Totaalkost/test 32,28
• Honoraria RIZIV voor ambulante patiënt en
  enkelvoudig voorschrift (B450-test) 23,23
• Nettokost/test 9,05
• Prijs CycleTEST PLUS DNA reagens kit (BD 40
  testen) 233
• Prijs DNA QC Particles kit (BD 25 controles)
  294

35
OVERGEBRUIK/ONDERGEBRUIK DNA-ANALYSE

• UZ Leuven enkel bij nieuwe diagnose pediatrische
  ALL
• Andere mogelijke indicaties
• Multiple myeloma (hyperdiploïdie hier ook betere
  prognose)
• Non-Hodgkin lymfomen (S-fase fractie)
• Vaste weefseltumoren (bijv. borsttumor S-fase
  fractie)
• Andere ziekenhuizen
• UZ Gent ALL, neuroblastoma (reagens kit Beckman
  Coulter)
• AZ VUB ALL (stalen worden doorgestuurd naar
  extern labo)
• Virga Jesse Hasselt multiple myeloma, lymfomen,
  weefseltumoren (reagens kit BD)
• UZA multiple myeloma (zelf-bereide reagentia)
• DNA FCM en karyotypering gelijktijdig uitgevoerd
  om risico op vals negatieven te beperken,
  sequentiële strategieën echter meer
  kosten-efficiënt

36
Gaan we de DNA-analyse behouden of afschaffen in
ons laboratorium?
37
PRO
CONTRA

• Snelle antwoordtijd (meestal binnen 24 uur)
• Pediaters voor behoud DNA FCM en karyotypering
  als wederzijdse controle ? keuze therapieschema

• Sensitiviteit in ons labo slechts 71 bij cut-off
  DI 1,16
• DI is géén vereiste voor risico stratificatie
  (ploïdie via karyotypering volstaat)
• Karyotypering en FISH superieur aan DNA FCM
• Analyse is verlieslatend
• Mogelijkheid van doorsturen naar extern labo
  (echter antwoordtijd ? )

38
KWALITEIT VERBETEREN?

• Aliquots maken van de reagentia en bewaren op
  -18C
• Adequate interne controle PBMC i.p.v. vol bloed
• QC-kit of overeenkomst met BD voor
  (half)jaarlijkse controle en kalibratie zoals
  voor de overige flowcytometrische testen
• Eventueel zelf-bereide reagentia i.p.v.
  commerciële kit (goedkoper, langere houdbaarheid)
• Verhogen uitvoerfrequentie (M. Kahler, lymfomen,
  weefseltumoren)?

39
TO DO

• Overleg met de pediaters voor- en nadelen van de
  DNA-analyse goed tegen elkaar afwegen ? test al
  dan niet afschaffen
• Indien de test behouden blijft, stappen
  ondernemen om de kwaliteit te verbeteren
  (aliquots, PBMC, afspraken BD, )
• Pediaters informeren over de matige lineariteit
  tussen DI en chromosomen voorzichtigheid
  geboden bij hanteren van de cut-off van 1,16

40
THE END