Analyse bioinstrumentale

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Analyse bio-instrumentale

• A. Garnier
• GCH-21399
• A-2007

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Mise en contexte

• Problème réel Quantifier la production en
  adénovirus recombinant, produit par culture de
  HEK-293S
• Dynamique de la production
• Méthodes standards longues, fastidieuses et peu
  précises.
• Méthode indirecte, 1ère génération suivre la
  protéine dintérêt (ici la PTP1C)
• Méthode de 2ème génération suivre lexpression
  dun gène rapporteur (ici la green fluorescent
  protein , GFP) suite à une infection secondaire,
  puis mesure au (fluorescence assisted cell sorter
  (FACS directe ou indirecte?

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Titration virale Méthode de plage de lyse
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FACS
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Fluorescence
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Généralisation

• Lutilisation de gènes rapporteurs (reporter
  genes) est très fréquente
• GFP, lac Z (le gène de la b-galactosidase, gène
  de la luciférase)
• Distinction importante entre méthode directe et
  indirecte
• Appliquer au cas de la mesure de la concentration
  en micro-organismes

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Méthodes directes pour la biomasse

• Masse sèche (filtration)
• Dénombrement
• Hemacymètre
• Coulter
• FACS
• Avantages et inconvénients
• Autres méthodes directes utilisation de
  colorants, CFU, dilutions limites

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Quelle est la précision des méthodes basées sur
le dénombrement

• Rappel de la loi de Poisson
• x nb dévènements quelconques observés dans un
  espace dimensionnel quelconque
• n espérance de x
• espace dimensionnel peut être le temps, une
  longueur, une surface, un volume, etc
• Alors

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Exemple classique le standard téléphonique

• Un standard reçoit en moyenne 60 appels/h. quelle
  est la probabilité quil reçoive 0, 1, 2, 3, etc
  appels durant la prochaine minute?
• n 1 appel/minute
• x 0, 1, 2, 3, etc
• P(0,1) exp(-1)10 / 0! 0,368
• P(1,1) exp(-1)11 / 1! 0,368
• P(2,1) exp(-1)12 / 2! 0,184
• P(3,1) exp(-1)13 / 3! 0,06 ..

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Pr(x,1) vs x, pour n1
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Pr(x,100) vs x
/- 10
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Écart-type de la loi de Poisson

• É.-t. (s) n1/2
• Estimation de lé.-t. (s) x1/2
• Estimation de lé.-t. relatif s/x x-1/2
• Indication pour le dénombrement
• Limite inférieure 100-200 évènements
• Limite supérieure comptabilité !

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Autre application de la loi de Poisson dilutions
limites
Ex concentration dun échantillon en
micro-organismes 107 cellules/mL
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1 mL déchantillon
?
Milieux initialement stériles
9 ml
9 ml
9 ml
9 ml
9 ml
9 ml
9 ml
9 ml
7 éprouvettes contenant chacune 9 mL de milieu de
culture stérile, inoculées, laissées à incuber
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On peut calculer la probabilité que P(xgt0,n)
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Dilutions limites répétées (ex préc.)
P(xgt0,n)3/5 n1 X 107 !!!
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Méthodes indirectes de détermination de la
concentration en micro-organismes

• Densité optique
• Turbidité 545 nm
• Labsorption lumineuse peut également servir à
  déterminer la concentration en
• Protéines 214nm (lien peptidique), 280nm
  (aromatiques Tyr, Trp, Phe)
• ADN 260 nm
• Fluorescence

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Autres mesures du déroulement dun procédé de
bioproduction

• Nutriments sucres, ac. aminés, vitamines, O2
• Constituants cellulaires ADN, protéines, ARN
  (gene chip)
• Sous-produits métaboliques acides organiques,
  alcools, ammoniaque, CO2
• Produit dintérêt
• Autres pH, T, vitesse dagitation, viscosité,
  mousse, marqueurs cellulaires, etc

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Composition cellulaire
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Variation de la composition cellulaire
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Méthodes

• Sondes pH, OD, pCO2, T
• Tests enzymatiques, exemples
• Glucose par hexokinase(hk) (mesure de la
  fluorescence du NADH exc. 320-370, ém 420-460)
• Glucose ATP hk G6P ADP
• G6P NAD glucose-6-phosphate déshydrogénase
  (G6PDH) 6-PG NADH
• G6PDH par G6P
• G6P NADP G6PDH 6-PG NADPH

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Méthodes (suite)

• Immuno-affinité Anticorps-antigène

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Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
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La Polymerase Chain Reaction (PCR)
Animation tirée du site du Réseau Lyonnais
d'Ingénierie Éducative (RELIE), École Normale
Supérieure de Lyon (cliquez sur le lien).
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PCR en temps réel (real time)
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Expression génétique

• Biopuces

(cliquez sur une des images pour lanimation)
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Séparation détection

• Électrophorèse (SDS-PAGE)

Western EP anticorps spécifiques à
protéines Southern EP ADN marqué Northern
EP ARN marqué
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Électrophorèse SDS-PAGE
Tiré de Segura, Garnier et al (2007). Figure 2.
Fractionation of purified retroviral vector
preparations by 1D Gel ElectrophoresisPurified
virus preparations with (a) and without (b)
subtilisin treatment were fractionated on a 4-12
Tris-Glycine polyacrylamide gel (Invitrogen) run
under reducing conditions and visualized by
silver staining. Protein bands from gel b were
excised and subjected to in-gel tryptic digestion
prior to MS/MS analysis. Bands containing
statistically significant peptide identifications
(A-L) are indicated on gel b. Figure 2c shows the
protein profiles of samples a (green) and b
(blue) superimposed. The theoretical migration
positions of all MoMLV viral-encoded proteins are
indicated in figure c.
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Gel délectrophorèse 2-D
2-DE des protéines soluble de levures
(Échantillon de sérum sanguin, Gygi et al., 2000)
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Séparation détection chromatographieEx High
Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

• Échange dions
• Tamis moléculaire
• Interaction hydrophobe
• Phase inverse
• Électrophorèse

• Automatique
• Réfrigéré

Échantilloneur
Réservoir de Phase mobile
Pompe
Colonne
Détecteur
Collecteur de fraction
Échantillon

• UV/visible
• Fluorescence
• Infra-rouge
• Indice de réfraction
• Conductivité
• Spectrométrie de masse

• En fonction
• de la colonne
• Gradient

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Exemple de HPLC (Agilent 1100)
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Hydrolysat trypsique de la BSA
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Chromatographie
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Chromatographie (suite)
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Chromatographie (suite)

• Temps de rétention identification surface sous
  le pic quantification
• tM temps délution de la phase mobile
• tR temps de rétention
• tR temps de rétention réduit tR-tM
• k facteur de fixation tR/tM
• s écart-type dun pic gaussien
• d largeur du pic à mi-hauteur 2,354 s
• w largeur du pic à la base 4 s
• s/tR écart-type relatif
• N efficacité de la colonne (tR/s)2 5,545
  (tR/d)2 16 (tR/w)2
• N nb de plateau théorique
• H hauteur de plateau théorique L/N, où L
  longueur de la colonne
• Exemple 2 colonnes de 25 cm, 1 et 2
• tR1 416,4 - tR2 481,2
• d1 10,2s - d2 13,2s
• Calculez N1, N2, h1, h2 identifiez la colonne la
  plus efficace

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Chromatographie (suite)

• Pour 2 pics
• a facteur de sélectivité tRB/tRA kB/kA,
  où B est le pic le plus à droite
• Pour phase stationnaire, phase mobile et T
  données, aconstante
• Résolution (RS) Dt/w

Exemple, 3 pics A, B et C tM 83,4s
tR(A) 195s tR(B) 415,4 tR(C) 481,2 Calculez
aB/A et aC/B
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Chromatographie (suite)
Calcul de Résolution (RS)
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Spectroscopie de masse arc magnétique
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Spectrométrie de Masse - Quadrupole

• m/z 10-4000
• Précision m/z 0.1-0.2
• Vitesse de balayage 5000 m/z par sec
• Le temps de vie dun ion de sa formation a sa
  détection 40-100 µs.

www.bris.ac.uk
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Spectrométrie de Masse - Temps dEnvol (TOF)

• Lincorporation dun réflectron dans le tube du
  TOF ou une extraction ionique délayée (Cornish et
  Cotter, 1994 Cotter et al., 2004)
• TOF est communément employé avec MALDI, il peut
  aussi être utilisé avec un ESI (Boyle et
  Whitehouse, 1992)

www.chemistry.adelaide.edu.au
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Spectroscopie de masse 3 (GCMS)
41
Spectroscopie de masse 1
42
Spectroscopie de masse 4 (LCMS)
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Tout est dans l'interface LC-MS

• L'electro-atomisation (electro-spray ionisation,
  ESI)

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Spectrométrie de Masse analyse de protéines par
MSMS
Dissociation nomenclature fragment proposée par
Roepstorff, 1984
(Yates, 1998 Westermeier et Naven, 2002 Graves,
2002)
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Exemple d'analyse MSMS

• Albumine

Protéine majeure du sérum sanguin (20-30 g/L),
souvent utilisé en milieu de culture de cellules
de mammifères
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Exemple d'analyse MSMS

• Albumine

gtP02769ALBU_BOVIN Serum albumin - Bos taurus
(Bovine). MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGE
EHFKGLVLIAFSQYLQQCPF DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKS
LHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP
ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHP
YFYAPELLYY ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQ
RLRCASIQKFGERALKAWSVA RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKEC
CHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE
CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFL
GSFLYEYSRR HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDK
LKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE
VSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL
NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLF
TFHADICTLP DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVD
KCCAADDKEACFAVEGPKLVV STQTALA
Number of amino acids 594 Molecular weight
68026.9 Theoretical pI 5.77
Informations obtenues sur Expasy
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Albumine fragments trypsiques
48
Analyse LC et MS1 de l'albumine trypsique
ANALYSE MS2, cliquez ici
Identification de protéine, cliquez ici (Logiciel
Mascot, Matrix Science)
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Protéomique du sérum sanguin

• 60 à 80 g/L de protéine (Tirumalai et al., 2003)
• 10 000 protéines différentes
• 22 protéines 99 de la quantité protéinique du
  sérum (Zhang et al., 2005)
• 12 log de variation de concentration (Anderson et
  Anderson, 2002 Zhang et al., 2005)

Tirumalai et al., 2003
50
Protéomique du sérum sanguin
Anderson et Anderson, 2002
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Microscopie de cellules vivantes
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Imagerie hyper-spectrale