Capacidad de uni

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Capacidad de unión lipídica de la Hemocianina en
arañas

• Integrantes
• Faura, Solange
• Luna, Julia
• Zúñiga, Emiliano

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• Hemocianina
• Pigmento respiratorio de invertebrados.
• Primer reporte de Hemocianina unida a lípidos por
  Zatta (81) en Carcinus maenas, con supuesta
  función estabilizadora de la estructura proteica.

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• En trabajos posteriores con Octopus tehuelchus se
  sugirió la posible función de la hemocianina como
  apolipoproteína.
• Se encontraron tres lipoproteínas (VHDL, HDL y
  LDL) que contenían Hemocianina.

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• En Ampullaria canaliculata se encontraron
  abundantes concentraciones de Hemocianina
  asociadas a pequeñas cantidades de lípidos.

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• En arácnidos se estudiaron tres especies
  Eurypelma californicum, Polybetes pythagoricus,
  Latrodectus mirabilis.
• Tomando como objeto de estudio P. pythagoricus se
  procedió a aislar la lipoproteína, extraer los
  lípidos y reconstituir la misma con distintos
  lípidos para medir la capacidad de unión con cada
  uno de ellos.

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Materiales y métodos

• Aislamiento de la fracción lipoproteica de la
  hemolinfa
• Ultracentrifugación plasmática en gradientes de
  densidad.
• Se agregó un inhibidor de proteasas (TRASYLOL)
  con NaBr.
• Centrifugación 178.000 g durante 24 Hs.
• Separación en alicuotas de 0.3 ml.
• Monitoreo por espectrofotometría a 280 nm.

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• Deslipidación y reconstitución de la fracción
  lipoproteica
• Se deslipida el VHDL con Triton-X-100, 0,02 gr/gr
  de proteína.
• Se incuba a temperatura ambiente durante una
  hora, con agitación.
• Se elimina el detergente.
• La fracción sin lípidos se extrae con solventes
  orgánicos.
• Se analiza por TLC-FID, para corroborar la
  ausencia total de lípidos.

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• Se reconstituyen las fracciones de lipoproteína
  con lípidos marcados radioactivamente con C14.
• Acido Palmítico
• Fosfatidilcolina
• Colesterol
• Trioleina

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Separación cromatográfica de la fracción marcada
y cuantificación de los lípidos unidos a la
hemocianina

• Las muestras reconstituidas se analizaron con
  HPLC (Cromatografía líquida de alta resolución)
  empleando columnas de exclusión molecular.
• Las fracciones eluidas se analizaron en cuanto a
  su contenido
• - Lipídico mediante radiactividad (medidas
  con un
  Cocktail de Centelleo Líquido).
• - Proteico mediante espectofotometría a 280nm.

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Resultados

• El análisis de la espectrofotometría dio lugar a
• un gráfico donde se pueden apreciar 3 picos en
• los valores de absorbancia.

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• Se observaron tres subfracciones de la
  hemocianina correspondientes a I) Heptámeros
• II)
  Hexámeros
• III)
  Monómeros
• Se separó la fracción de mayor absorbancia, que
  contiene VHDL, la cual presenta la mayor
  concentración de Hemocianina.
• Con el análisis de TLC-FID se confirmó que no se
  presentan lípidos en la fracción proteica.

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• Cuando se incrementan las
• cantidades de lípidos incubados
• con cantidades constantes de
• hemocianina deslipidada,
• se observan diferentes
• proporciones de lípidos unidos a
• la proteína, tendiendo a una
• relación hiperbólica.

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• La proporción molar máxima (Mr) entre
• lípido/Hemocianina, se obtuvo en la fracción
• de ácido grasos libes (ácido palmítico).
• La proporción molar mínima (Mr) entre
• lípido /Hemocianina se obtuvo en la fracción
• de Trioleina (Triacilgliceroles).

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• Los valores más bajos de la constante de
  disociación (Kd) se obtuvieron en la
  fosfatidilcolina y en el colesterol.
• Los valores más altos de efectividad máxima de
  unión inicial lípido/proteína (Eo), se obtuvieron
  en el colesterol y fosfatidilcolina.
• Los valores de Eo son inversamente proporcionales
  a los valores de Kd.

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• La proporción molar lípido/proteína in vitro en
  todos los casos fue mayor que la encontrada bajo
  condiciones fisiológicas.

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• Hemocianina nativa tiene una
• estructura dihexamérica. Esta puede
• perderse por cambios en el PH,
• concentraciones de cationes
• divalentes y el NaBr
• (Ultracentrifugación).
• De las tres subfracciones de Hemocianina,
  solamente la hexamérica es similar a la
  estructura nativa y es capaz de unir lípidos in
  vitro.
• En su estructura existen dominios de baja
  polaridad que son capaces de interactuar con
  lípidos.
• Se presentan zonas hidrofóbicas que producen la
  gradual saturación de los sitios de unión a
  lípidos, generando así la relación hiperbólica
  antes mencionada.

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• Bajo condiciones de saturación con colesterol y
  cantidades variables de fosfatidilcolina, se
  llega a un reemplazo equilibrado entre ésta y el
  colesterol.

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• Mediante este trabajo se confirmó que la
  hemocianina es la apolipoproteína de unión de
  lípidos de VHDL.

19

• ???

20

• Posible trabajo posterior
• Determinar el por qué de las variaciones entre
  PMR y Mr/PMR.
• Estudiar la posible variación de la unión de
  lípidos a hemocianina bajo fluctuaciones en el
  nivel de Oxígeno.
• Cómo varía la proporción molar lípido/hemocianina
  en diferentes condiciones estacionales y
  diferentes estadios del desarrollo.

21

• GRACIAS!!!!!