CHMI 2227F Biochimie I - PowerPoint PPT Presentation

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CHMI 2227F Biochimie I

Description:

CHMI 2227F Biochimie I Purification et caract risation des prot ines CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. * CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. * S quen age des ... – PowerPoint PPT presentation

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Title: CHMI 2227F Biochimie I


1
CHMI 2227FBiochimie I
  • Purification et caractérisation des protéines

2
Purification des protéines
  • Les protéines sont toujours retrouvées en tant
    que composantes dun mélange complexe incluant
    dautres macromolécules biologiques
  • Alors que certaines protéines sont très
    abondantes (anticorps sanguins), dautres ne sont
    rencontrés quen quantités très infimes (quelques
    molécules par cellule)
  • La première étape dans létude de la
    structure/fonction dune protéine sera donc
    toujours sa purification
  • À partir dun échantillon biologique contenant la
    protéine dintérêt, on effectue une série
    dexpériences effectuées séquentiellement qui
    permettront progressivement dobtenir la protéine
    désirée sour forme  pure 
  • La purification dune protéine est grandement
    facilitée si on connaît au départ
  • Les caractéristiques physico-chimiques générales
    de la protéine Mr, pI, solubilité
  • Si une méthode expérimentale permet de détecter
    la présence de la protéine (réactifs, réaction
    enzymatique, effect physiologique, etc).

3
Purification des protéines Procédure générale
4
Purification des protéines 1. Méthodes grossières
  • Basées sur la solubilité de la protéine dintérêt
    sous différentes conditions
  • pH
  • Température
  • Force ionique (i.e. concentration en sels)
  • Lidée de base est dutiliser des conditions
    expérimentales qui feront précipiter beaucoup de
    protéines de notre extrait brut, tout en laissant
    notre protéine dintérêt en solution
  • Permet de nous débarrasser dune bonne partie des
    cochonneries  présentes dans lextrait brut

5
Précipitation différentielle1.1. Précipitation
par modification du pH
  • La solubilité des protéines est rendue possible
    par des interactions entre les chaînes latérales
    et le solvant
  • Si le solvant est leau
  • Liaisons hydrogène
  • Interactions électrostatiques
  • Si le solvant est non-polaire
  • Interactions hydrophobes
  • Ces interactions peuvent être modifiées en
    changeant la charge nette de la protéine, donc en
    modifiant le pH du solvant
  • De manière générale, les protéines précipitent
    lorsque le pH de la solution est égal au pI de la
    protéine
  • Les protéines saggrègent et formeront des
    agglomérats qui précipiteront.

6
Précipitation différentielle 1.2 Salting out 
  • La solubilité des protéines peut aussi être
    modifiée en altérant la concentration de sel dans
    lextrait
  • Les sels ajoutés prendront la place de leau
    autour de la protéine
  • Les sels neutraliseront les charges des chaînes
    latérales de la protéine
  • Ces deux evènements favoriseront laggrégation et
    la précipitation des protéines
  • Généralement, le  salting out  est fait par
    lajout de sulfate dammonium
  • (NH4)2SO4
  • Plus soluble dans leau que le NaCl
  • Requiert une quantité moins grande que le NaCl
    pour précipiter les protéines.
  • Une protéine donné précipitera généralement
    lorsquune concentration spécifique de (NH4)2SO4
    est atteinte
  • Ceci permet de nettoyer notre extrait brut de
    manière séquentielle
  • Les protéines précipitées sont alors jetées à la
    poubelle, ou sujettes à la dialyse (pour enlever
    le sel de léchantillon)

7
Précipitation différentielle 1.2.Salting out
PRECIPITATION!!
8
Précipitation différentielle 1.2.Salting out
  • Centrifugation
  • Séparation selon la densité
  • Les molécules denses (i.e. grosses) vont
    sédimenter (former un culot) plus vite que les
    molécules moins denses (i.e. plus petites)

9
Centrifugation
  • Technique très utilisée permettant de séparer des
    substance via lapplication dune force
    centrifuge
  • Lintensité de la force centrifuge devant être
    appliquée varie selon la nature de la substance à
    séparer
  • 500 x g pour cellules entières
  • 15 000 x g pour les mitochondries
  • 150 000 x g pour les ribosomes
  • Note 1 x g force gravitationnelle terrestre au
    niveau de la mer ( 9.8 m/s2)
  • Les substances particulaires vont atteindre le
    fond du tube (i.e., elles forment un culot)
  • Le liquide résiduel est appelé le surnageant.
  • Peut aussi être utilisé pour séparer des
    substances particulaires de densité différente
    (les substances plus denses sédimenteront plus
    rapidement que celles qui sont moins denses.
  • e.g. séparation des érythrocytes et leucocytes

10
Dialyse
  • Parce que le sel ajouté pour le  salting out 
    inhibe lactivité des protéines, il doit être
    enlevé avant de continuer la purification
  • Ceci est fait par dialyse
  • La solution de protéine est simplement introduite
    dans un sac fabriqué dune membrane
    semi-perméable
  • Perméable aux petites molécules (e.g. sels)
  • Imperméable aux protéines
  • Permet aussi de changer de tampon avant de
    procéder à létape suivante.

11
Purification des protéines2. Méthodes fines
  • Après avoir utilisé des méthodes grossières afin
    de concentrer notre protéine favorite, on utilise
    des méthodes plus raffinées afin de purifier
    notre protéine le plus possible
  • Ceci est fait généralement en utilisant
    différents types de chromatographie
  • Échange dions
  • Tamisage moléculaire
  • Affinité
  • Ceci est fait généralement en utilisant la Fast
    Protein Liquid Chromatography (FPLC).

12
Purification des protéines 2.1. Chromatographie
à échange dions
  • Permet de séparer les protéines selon leur charge
  • Le mélange de protéines est placé dans un tampon
    dont le pH permet à notre protéine davoir une
    charge précise
  • Le mélange est ensuite déposé sur la colonne de
    séparation
  • Échange de cations
  • Phosphocellulose
  • Carboxyméthyl (CM) cellulose
  • Échange danions
  • Diéthylaminoéthyl (DEAE) cellulose

13
Purification des protéines 2.1. Chromatographie
à échange dions
  • Même si un changement de tampon avec un pH
    différent permettrait déluer la protéine
    dintérêt, ceci est rarement effectué car le
    changement de pH pourrait dénaturer la protéine
    ou, pire, la faire précipiter
  • Lélution est faite en ajoutant un tampon
    contenant une concentration de sel (NaCl) qui
    empêche la protéine de lier la colonne
  • Lélution peut être faite à laide dun gradient
    linéaire de concentration de sel, ou par étapes

14
Purification des protéines 2.1. Chromatographie
à échange dions
15
Purification des protéines 2.2. Tamisage
moléculaire
  • Aussi appelé chromatographie par filtration sur
    gel ou chromatographie dexclusion
  • Consiste en de petites billes contenant des pores
    dune taille spécifique
  • Les protéines plus grosses que les pores
    nentrent pas dans les billes, ont moins de
    volume à traverser et vont éluer en premier
  • Les protéines plus petites que les pores vont
    entrer dans les billes de leur élution sera
    retardée elles élueront donc plus tard.
  • Les protéines sont séparées selon leur masse
    moléculaire
  • La disponibilité de différents types de billes
    possédant des pores de différentes tailles permet
    la sélection du matériel de chromatographie qui
    donnera le meilleur résultat

16
http//www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp0091
9.nsf/Content/LabSep_ProdSelGuidesMediaGFSelG
17
Purification des protéines 2.2. Tamisage
moléculaire
  • La filtration sur gel a plusieurs applications
  • 1) Purification des protéines
  • 2) Désalage
  • PAS la même chose que le salting out
  • Les pores sont si petits que toues les protéines
    éluent rapidement et seuls les sels voient leur
    élution retardée
  • 3) Détermination de la masse moléculaire
  • Nécessite dabord la calibration de la colonne
    avec des standards protéiques (un mélange de
    protéines de Mr connu)
  • Permet de déterminer si la protéine dintérêt
    fait parti dun complexe multimérique. POURQUOI?

18
Purification des protéines2.3. Chromatographie
daffinité
  • Dans ce type de chromatographie, des billes sont
    couplées à une molécule appelée ligand qui a la
    propriété de lier uniquement la protéine
    dintérêt
  • Ligand anticorps, substrat, métaux, autre
    macromolécule pouvant lier la protéine dintérêt.
  • Lorsquun mélange de protéines est filtré dans
    cette colonne, seule la protéine dintérêt sera
    retenue les autres protéines contaminants seront
    éluées
  • La protéine dintérêt est alors récupérée par
    lajout dun excès du ligand libre à la colonne
  • Cest une méthode très puissante, mais avec des
    limites importantes
  • Le milieu de séparation est très dispendieux (pas
    approprié pour des séparations à grande échelle)
  • Disponibilité limité des billes liées au ligand
    dintérêt
  • Nécessite la connaissance préalable du ligand
    pouvant lier spécifiquement la protéine dintérêt
    (ce qui est rarement le cas).

19
Analyse des protéinesÉlectrophorèse
  • Pendant toutes les étapes de purification, la
    présence et la pureté des la protéine dintérêt
    doivent être déterminés
  • Aussi, on a besoin de méthodes permettant
    détudier des protéines sans avoir à les
    purifier
  • Les méthodes les plus populaires pour analyser
    les protéines sont basées sur le principe de
    lélectrophorèse
  • Lélectrophorèse implique la séparation de
    protéines via leur migration dans un gel
    lorsquelles sont soumises à un champ électrique.
  • Le matériel habituel pour séparer les protéine
    par électrophorèse est le polyacrylamide

20
Électrophorèse1. Électrophorèse PAGE-SDS
  • En PAGE-SDS, les protéines sont tout dabord
    placées dans un tampon contenant le détergent
    docécyl sulfate de sodium (SDS)
  • Le SDS recouvre toutes les protéines de façon
    similaire on retrouvera environ 1 molécule de
    SDS par 2 acides aminés
  • Ceci a la conséquence importante de donner à
    chaque protéine la même densité de charge
    négative, indépendamment du pI de la protéine.
  • Le b-mercaptoéthanol (HS-CH2-CH2-OH) est aussi
    ajouté fréquemment (mais pas toujours) afin de
    briser les ponts disulfures.
  • Donc, en PAGE-SDS, la seule variable qui
    affectera la migration des protéines dans le gel
    est leur taille

21
Électrophorèse1. Électrophorèse PAGE-SDS
www.biology.ucsd.edu/classes/bggn224.FA06/crash_2.
ppt
http//wine1.sb.fsu.edu/bch5425/lect20/lect20.htm
22
Électrophorèse1. Électrophorèse PAGE-SDS
  • Les protéines sont alors placées dans un puits du
    gel PAGE-SDS, et soumises à un champ électrique
  • Le protéines migreront alors vers lanode
    positive la distance migrée dépendra de la
    taille des protéines
  • Les protéines sont visualisées à même le gel
    grâce à un colorant bleu appelé Bleu de
    Coomassie
  • En plaçant, dans un puits adjacent, un mélange de
    protéines de masse moléculaire connue (standard
    de protéines), on peut déterminer la masse
    moléculaire de la protéine dintérêt
  • À noter le traitement au SDS et b-ME dénature
    les protéines et brise toutes les interactions
    entre protéines la protéine migrera donc en tant
    que simple chaîne polypeptidique.
  • En certaines occasions, un PAGE NATIF est
    effectué dans cette situation, on ninclus pas
    le SDS ni le b-ME. Ceci permet détudier des
    protéines faisant parti de complexes
    multimériques. POURQUOI?

23
Électrophorèse1. Électrophorèse PAGE-SDS
24
Électrophorèse1. Électrophorèse PAGE-SDS
25
Électrophorèse2. Focalisation isoélectrique
  • Ici, les protéines sont séparées selon leur pI
  • Un mélange de protéines est placé dans les puits
    dun gel dacrylamide contenant un gradient de pH
    sur toute sa longueur
  • En soumettant les protéines à un champ
    électrique, elles migreront dans le gel selon
    leur charge
  • Protéines chargée positivement migreront vers la
    cathode négative
  • Protéines chargées négativement migreront vers
    lanode positive
  • Lorsquune protéine atteint une zone du gel où pH
    pI, elles sera neutre et arrêtera de migrer
  • Cette méthode permet donc de déterminer le pI de
    la protéine dintérêt

26
Électrophorèse2. Focalisation isoélectrique
27
Électrophorèse3. Électrophorèse à deux dimensions
  • Ici, les protéines sont dabords séparées en
    fonction de leur pI par focalisation
    isoélectrique.
  • Ensuite, la bande de gel de focalisation
    isoélectrique est placée sur un gel de PAGE-SDS
    les protéines seront alors séparées selon leur
    Mr
  • Cette méthode très puissante permet dobtenir une
    très grande résolution dans la séparation de
    protéines présentes dans un mélange complexe.

28
Électrophorèse3. Électrophorèse à deux dimensions
29
Électrophorèse 4. Analyse Western
  • Application très puissante du PAGE-SDS
  • Permet la détection dune seule protéine présente
    dans un mélange très complexe
  • Basé sur la propriété des anticorps de lier une
    seule molécule avec une très grande affinité
  • Anticorps
  • 4 chaînes 2 chaînes légères (25 kDa chacune) et
    2 chaînes lourdes (50 kDa chacune)
  • Chaque anticorps possède deux sites de liaison
    pour un même antigène (antigène la molécule
    pouvant être liée spécifiquement et uniquement
    par lanticorps).

30
Électrophorèse 4. Analyse Western
31
Purification des protéines Exemple et analyse
des données
  • À chaque étape, on prélève 3 échantillons
  • Un pour déterminer la quantité de protéines
    présentes
  • Un pour mesurer lactivité de la protéine
  • Un pour faire un gel PAGE-SDS
  • Le reste de la fraction est soumise à létape de
    purification suivante

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Purification des protéines Exemple et analyse
des données
33
Purification des protéinesExemple et analyse des
données
  • Informations importantes à obtenir afin dévaluer
    le succès de la purification (surtout lorsquon
    met au point la méthode de purification)
  • Activité spécifique (unités/mg) Activité totale
    (U)/ Protéine totale (mg)
  • Rendement (Activité totale à étape Y / Activité
    totale dans lextrait brut) x 100
  • Niveau de purification Activité spécifique à
    létape Y / Activité spécifique dans lextrait
    brut

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Séquençage des protéines
  • Toutes les propriétés structurales et
    fonctionnelles des protéines dépendent de lordre
    des acides aminés dans le polypeptide (sa
    séquence)
  • La structure 3-D dune protéine est uniquement
    attribuable à la séquence en acides aminés de la
    protéine
  • Plusieurs maladies héréditaires sont causées par
    une changement (insertion, délétion,
    substitution) dun ou plusieurs acides aminés
    dans une protéine
  • Les acides aminés importants dans la
    structure/fonction dune protéine ne varient
    généralement pas toujours au cours de
    lévolution.
  • La comparaison de séquences en acides aminés de
    protéines provenant de plusieurs espèces permet
    de révéler des fonctions/propriétés de la
    protéine dintérêt.

35
Séquence des protéines - anémie falciforme
  • Lhémoglobine est un tétramère fait de 2 copies
    chacun de 2 polypeptides HbA et HbB
  • Lanémie falciforme est causée par une mutation
    héréditaire dans la chaîne HbB
  • Glu remplacé par Val
  • Crée une région hydrophobe (pourquoi?) qui mène à
    lagrégation de lhémoglobine mutée (appelée
    HbS).
  • Cette HbS agrégée forme de longs filaments qui
    changent la forme des érythrocytes. Ces
    érythrocytes allongés bloquent le flot sanguin.
    Ces cellules allongées sont aussi très fragiles
    et vont facilement éclater, causant une anémie.
  • MAIS parce que le parasite causant la malaria
    pousse dans les érythrocytes, les gens souffrant
    danémie falciforme sont plus résistant à la
    malaria.

36
Détermination de la séquence 1. cartographie
avec enzymes
  • Basé sur la propriété de réactifs
    chimiques/enzymes de couper le lien peptidique à
    un endroit très précis

Enzyme Acide aminé Site de coupure
Trypsine Arg/Lys C-ter
Chymotrypsine Phe/Trp/Tyr C-ter
Protéase V8 Asp/Glu C-ter
Pepsine Phe/Trp/Tyr N-ter
Thermolysine Leu/Ile/Trp/Tyr/ Val/Ala/Phe N-ter
Carboxypeptidase A Tous les a.a. en C-ter., sauf Pro, Arg/Lys - Libère lacide aminé C-ter - Ne coupe pas si Pro est lavant dernier acide aminé.
Carboxypeptidase B Seulement Arg/Lys quant C-ter. - Libère lacide aminé C-ter - Ne coupe pas si Pro est lavant dernier acide aminé.
Réactif Acide aminé Site de coupure
Bromure de cyanogène Met C-ter
b-mercaptoéthanol Cys Ponts disulfure
Iodoacétate Cys Prévient la réduction des ponts disulfure
1) 1-Fluoro-2,4 dinitrobenzène (FDNB) 2) Chlorure de dansyl 3) Chlorure de dabsyl Détruit tous les acides aminés sauf ceux en N-ter. Détruit tous les acides aminés sauf ceux en N-ter.
Hydrazine Détruit tous les acides aminés sauf ceux en C-ter. Détruit tous les acides aminés sauf ceux en C-ter.
NOTE Trypsine, Chymotrypsine, protéase V8,
pepsine et thermolysine ne COUPENT PAS si Pro
fait partie du lien peptidique.
37
Détermination de la séquence 1. cartographie
avec enzymes exemple 1
38
Détermination de la séquence 1. cartographie
avec enzymes exemple 2
  • Les données suivantes ont été obtenus après
    traitement dun octopeptide
  • HCl 6M Ala, Gly2, Lys, Met, Ser, Thr, Tyr
  • CNBr 2 peptides sont obtenus
  • Peptide 1 Ala, Gly, Lys, Thr
  • Peptide 2 Gly, Met, Ser, Tyr
  • Trypsine 2 peptides sont obtenus
  • Peptide 3 Ala, Gly
  • Peptide 4 Gly, Lys, Met, Ser, Thr, Tyr
  • Chymotrypsine 2 peptides sont obtenus
  • Peptide 5 Gly, Tyr
  • Peptide 6 Ala, Gly, Lys, Met, Ser, Thr
  • FDNB donne Gly
  • Carboxypeptidase A donne Gly
  • Quelle est la séquence de ce peptide?

39
Détermination de la séquence 2. Dégradation
dEdman
  • Basé sur lutilisation du phényl isothiocyanate
    (aka PTC réactif dEdman)
  • Le PTC réagit avec et marque lacide aminé en
    N-terminal du peptide
  • Lacide aminé marqué au PTC est libéré du peptide
    et identifié par chromatographie
  • Plusieurs cycles de marquage et libération
    permettent de déterminer la séquence du peptide.

40
Détermination de la séquence 2. Dégradation
dEdman
Identification
41
Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de
masse
  • Technique à la mode très puissante, permettant
    didentifier et de séquencer les protéines
  • Les protéines sont vaporisées en fragments
    ionisés à laide dun rayon laser
  • Même des protéines coupées dune gel PAGE-SDS
    peuvent être utilisées!!!
  • Les fragments sont séparés et leur masse
    moléculaire déterminée
  • À partir de la masse moléculaire, le peptide peut
    être identifié
  • En spectrométrie de masse en tandem (MS-MS), des
    fragments obtenus après une première ronde de MS
    sont sélectionnés pour une deuxième ronde de
    fragmentation et analyse la masse de ces petits
    fragments permet de séquencer les fragments
    peptidiques.

42
Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de
masse
43
Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de
masse
44
Exemple de purification de protéine
Apoptose un type de mort cellulaire
Normale
Autophagie
Current Opinion in Cell Biology 2004, 16663669
Apoptose
Nécrose
45
Apoptose aspects morphologiques
46
Apoptose aspects morphologiques
http//www.nature.com/nrm/journal/v9/n3/extref/nrm
2312-s1.mov
47
Apoptose et physiologie
48
Exemple de purification protéique Acinus une
protéine impliquée dans la mort cellulaire
49
Condensation de la chromatine et fragmentation du
noyau pendant lapoptose
50
Exemple de purification protéique Acinus une
protéine impliquée dans la mort cellulaire
51
Exemple de purification protéique Acinus une
protéine impliquée dans la mort cellulaire
  • Lane 1, 100,000g supernatant (3.4mg)
  • lane 2, HiTrap-Q(1.7mg)
  • lane 3, Heparin Sepharose after passing the
    hydroxyapatite column (150 ng)
  • lane 4, Phenyl Sepharose (70 ng)
  • lane 5, Superose 12 (50 ng) lane 6, Mono-Q (2.5
    ng).
  • Arrowhead, position of purifed Acinus p17 protein.

52
Exemple de purification protéique Acinus une
protéine impliquée dans la mort cellulaire
53
Exemple de purification protéique Acinus une
protéine impliquée dans la mort cellulaire
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