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Estudo do complemento

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Title: Estudo do complemento


1
Estudo do complemento
2
O sistema do complemento
3
Testes funcionais do complemento (I)
  • CH50
  • Baseada na lise pelo complemento de eritrócitos
    de carneiro sensibilizados com anticorpo de
    coelho anti-eritrócitos de carneiro
  • Diluições seriadas de soro teste são misturados
    com igual volume dos eritrócitos sensibilizados e
    incubados a 37ºC
  • A reacção é parada com PBS frio
  • A lise é estimada pela hemoglobina por
    espectrofotometria
  • Comparação com 0 de lise (sem soro) e 100 lise
    (por acção de água pura).
  • Actividade do complemento dada pela diluição
    necessária para obter 50 de lise. Resultado
    expresso pelo inverso desta diluição em unidades
    de CH50/mL soro.
  • Resultado baixo pode significar deficiência ou
    consumo
  • Heterozigotos têm habitualmente valores
    normais-baixos de CH50

4
Testes funcionais do complemento (II)
  • AH50
  • Semelhante ao CH50, por se basear na
    quantificação da lise de eritrócitos
  • Baseia-se no facto de a via alterna ser activada
    por e provocar a lise de eritrócitos de coelho
  • Activação da via clássica inibida por quelatação
    do Ca2 com EGTA
  • A maior parte das deficiências de C3 por consumo
    são devidas à activação da via alterna, devido ao
    ciclo de amplificação do C3

5
Testes funcionais do complemento (III)
  • Outros
  • ELISA
  • Detecção do componente terminal da cascata de
    activação clássica
  • C5b-6-7-8-9
  • Medida de lise de liposomas contendo enzimas
  • Utiliza processos automáticos de quimica clínica

6
Testes funcionais do complemento (IV)
  • Testes funcionais para componentes do complemento
  • Fazer CH50 ou AH50 com
  • Complementação por soros deficientes num
    componente
  • Complementação com componentes puros

7
Testes quantitativos do complemento
  • Quantificação de proteínas do complemento
  • Identificação das deficiências
  • Quantificação de produtos de hidrólise do
    complemento
  • Diferenciação entre deficiência e consumo
  • C4a/C4 ou C4d/C4gt via clássica
  • Bb gt via alterna
  • C3a e C5a gt via final (mas têm curtas
    semi-vidas, pelo que a Protein S é uma melhor
    alternativa)
  • Nefelometria

8
(No Transcript)
9
Colheitas
  • Má colheita gt deficiência de complemento
  • Evitar gt2 ciclos de congelação/descongelação
  • Soro com crioglobulinas tem que ser testado de
    imediato
  • Utilizar tubo sem anticoagulante, deixar coagular
    (30 min a 37ºC ou 60 a RT), centrifugar e guardar
    a 70ºC
  • Tempo excessivo de espera origina deficiência (as
    proteases celulares degradam as proteínas do
    complemento)
  • Crioglobulinas, complexos imunes, bactérias e
    particulas activam o complemento in vitro
    provocando falsa deficiência
  • Hemólise interfere na leitura

10
Análise Genética do C4
11
O Gene do C4 localiza-se no MHC-III
12
O gene do C4
  • dois genes
  • C4A (ácido)
  • C4B (básico)
  • 6p21.3
  • 41 exões
  • intrão 9 tem 7 Kb
  • Se intrão 7 presente o gene tem 21 Kb
  • Se intrão 7 ausente o gene tem 16 Kb.

13
Os Módulos RCCX
  • Módulo RCCX
  • RP1
  • C4
  • CYP21
  • Tenascin X
  • Normalmente 2 módulos em tandem
  • RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB

14
Os alelos C4A e C4B
  • C4B
  • o aminoácido nucleofílico (His) ataca o grupo
    tiol de um resíduo de cisteína, formando um
    intermediário acídico
  • C4A
  • a asparagina, não sendo nucleofílica não origina
    a formação do intermediário pelo que a reacção de
    ligação ás outras moléculas é mais lenta

15
TaqI - RFLP (quantificação dos elementos RCCX)
16
Taq I e pshA I RFLP
17
Imunofixação de C4A e C4B
18
(No Transcript)
19
Determinação de fenótipo C4
20
PFGE para genotipagem C4
  • M S gt 75Kb L gt 85Kb
  • B LS gt 105Kb LL gt 115 Kb
  • T
  • LSS gt 135 Kb
  • LLS gt 140 Kb
  • LLL gt 150 Kb

21
Número de módulos RCCX
RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB
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