Zastosowanie%20technik%20biologii%20molekularnej%20w%20diagnostyce%20chor

1
Zastosowanie technik biologii molekularnej w
diagnostyce chorób dziedzicznych

2
Choroba dziedziczna

• schorzenie spowodowane przez mutacje jednego lub
  wiecej genów lub tez aberracje chromosomalna
  przekazywane w rodzinie w kolejnym pokoleniu
• zmiany w DNA zostaja przekazane w gametach
  rodziców badz tez pojawiaja sie we wczesnych
  etapach rozwoju zarodkowego (jako mutacje de
  novo)

3
Test genetyczny

• analiza ludzkiego DNA, RNA, chromosomów, bialek i
  okreslonych metabolitów
• umozliwia identyfikacje odpowiednich genotypów,
  mutacji, fenotypów lub kariotypu
• wykonywany do celów klinicznych i poradnictwa
  genetycznego

4
Cel wykonywania testu genetycznego

• zdiagnozowanie genetycznej przyczyny choroby
• lub
• wykazanie, ze osoba posiada jedna lub wiecej
  zmian genetycznych
• mogacych spowodowac rozwój choroby lub
• mogacych wywolac chorobe u potomstwa lub
• majacych znaczenie dla postepowania leczniczego.

5
Testy genetyczne oparte na analizie DNA

• niezalezne od znajomosci patogenezy choroby
• niezalezne od ekspresji badanego genu
• wynik testu niezalezny od momentu wystapienia
  objawów klinicznych czy zmian w srodowisku
  mogacych wplywac na ujawnienie sie kliniczne
  genotypów
• wynik testu staly w ciagu calego zycia

6
Material do badan DNA
- krew obwodowa, - hodowla fibroblastów
skóry, - plamy krwi, - komórki nablonka jamy
ustnej, - cebulki wlosowe, do badan
prenatalnych - komórki plynu owodniowego, -
komórki trofoblastu (mozliwosc analizy w I
trymetrze ciazy) Specyficznosc analizy nie
zalezy od rodzaju tkanki uzytej do badania.
7
Strategie metodyczne w diagnostyce molekularnej
bezposrednia analiza mutacji
analiza sposobu dziedziczenia danego genu
(analiza sprzezen)
8
Analiza sposobu dziedziczenia (analiza sprzezen)

• polega na na sledzeniu w rodzinie przekazywania
  okreslonego markera genetycznego sprzezonego ze
  zmutowanym genem
• wykorzystuje fakt kosegregacji loci markera i
  genu powodujacego chorobe marker i gen ze
  wzgledu na bliskie polozenie na chromosomie
  dziedzicza sie wspólnie

9
Markery genetyczne stosowane w analizie sprzezen
Marker genetyczny dowolna sekwencja DNA
mozliwa do identyfikacji, wystepujaca w co
najmniej dwóch formach allelicznych 1. SNP
- Southern blotting, - PCR-RFLP, -
PCR-ASO, - sekwencjonowanie, -
mikromacierze 2. Sekwencje powtórzone (np.
mikrosatelitarne) - ocena wielkosci produktu
PCR w zelu poliakrylamidowym
10
Analiza sposobu dziedziczenia (analiza sprzezen)

• mozliwa nawet przy brak znajomosci/mozliwosci
  bezposredniej identyfikacji mutacji
  chorobotwórczej
• koniecznosc badania rodziców chorego
• nie sluzy do weryfikacji rozpoznania klinicznego
• (opiera sie na nim)
• umozliwia wykrycie nosicielstwa u krewnych
  chorego
• obciazona ryzykiem bledu wynikajacego ze zjawiska
  rekombinacji (badanie co najmniej dwóch markerów)

11
Analiza sposobu dziedziczenia markera XV2C
sprzezonego z genem CFTR w rodzinie ryzyka
mukowiscydozy.
12
Strategie metodyczne w diagnostyce molekularnej
bezposrednia analiza mutacji
analiza sposobu dziedziczenia danego genu
(analiza sprzezen)
13
Bezposrednia analiza mutacji

• weryfikuje rozpoznanie kliniczne
• brak ryzyka bledu diagnostycznego wynikajacego
  ze zjawiska rekombinacji
• konieczna znajomosc mutacji powodujacej chorobe
• Wspólczesna rutynowa diagnostyka molekularna
• glównie analiza znanych mutacji.

14
Bezposrednia analiza mutacji
poszukiwanie konkretnej mutacji/grupy mutacji
przeszukiwanie genu
15
Przeszukiwanie genu

• nie wiadomo, która z licznych mutacji powoduje
  defekt genu
• w populacji brak mutacji specyficznych o duzej
  czestosci wystepowania
• ? sekwencjonwanie, poprzedzone badaniem metoda
  przesiewowa (SSCP, HA, DGGE)

16
Bezposrednia analiza mutacji
przeszukiwanie genu
poszukiwanie konkretnej mutacji/grupy mutacji
17
Poszukiwanie konkretnej mutacji - mutacje
punktowe
1) analiza restrykcyjna - PCR-RFLP - Southern
blotting 2) PCR-ASO 3) sekwencjonowanie 4)
mikromacierze DNA
18
Analiza mutacji punktowej w genie ?-globiny
powodujacej anemie sierpowatokrwinkowa (Southern
blotting).
19
Poszukiwanie konkretnej mutacji insercje,
delecje, duplikacje
1) analiza wielkosci produktu PCR male
delecje 2) Southern blotting duze delecje lub
duplikacje, duze powtórzenia
trójnukleotydowe,
20
Analiza delecji ?508 w rodzinie ryzyka
mukowiscydozy (analiza dlugosci produktu PCR)
21

• 1. Czym spowodowane sa choroby dziedziczne?
• 2. Co to jest test genetyczny i do czego sluzy?
• 3. Jaki material stosuje sie do badania DNA w
  diagnostyce chorób dziedzicznych?
• 4. Na czym polega i do czego sluzy analiza
  sposobu dziedziczenia?
• 5. Na czym polega przeszukiwanie genu? Jakie
  techniki sie tu wykorzystuje?