ELV

1
ELVÁLASZTÁSTECHNIKA I.

• MINTAELOKÉSZÍTÉS
• ELMÉLETE, MUVELETEI ÉS ALKALMAZÁSAI
• Dr. Kremmer Tibor
• EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM
• Budapest

2
KÉMIAI TUDOMÁNYOKSZERVETLEN SZERVES
KLASSZIKUS SZERVETLEN ÉS SZERVES ANALITIKAI
KÉMIA BIOLÓGIA BIOMOLEKULÁRIS
KÉMIABIOANALITIKAELVÁLASZTÁSTECHNIKÁKELVÁLASZT
ÁSTUDOMÁNY
3
Paradigma váltás a BIOANALITIKÁBANPROTEOME(Was
inger et al. 1995) protein equivalent of a
genom protein complement encoded by a given
genomPROTEOMICS - GENOMICS
4
PROTEOMICS(Wang és Hanasch, 2003)
EXPRESSION PROTEOMICS  A genomban kódolt
valamennyi fehérje azonosítása és mérése,
Celluláris lokalizációjuk és poszt-transzlációs
módosításuk meghatározása. FUNCTIONAL
PROTEOMICS  A FEHÉRJÉK KÖLCSÖNHATÁSAINAK
VIZSGÁLATA AZ INDIVIDUÁLIS FEHÉRJÉK SZEREPÉNEK
MEGHATÁROZÁSA A SPECIFIKUS ANYAGCSERE
FOLYAMATOKBAN ÉS CELLULÁRIS STRUKTÚRÁKBAN A
FEHÉRJÉK SZERKEZETÉNEK ÉS FUNKCIÓJÁNAK FELDERÍTÉSE
5

•  

FUNKCIONÁLIS PROTEOMIKA BIOMOLEKULÁRIS KÉMIA
BIOPOLIMEREK MOLEKULA SZERKEZETÉNEK
KUTATÁSA  ANOMÁLIS MOLEKULASZERKEZETEK
KIMUTATÁSA  A FEHÉRJÉK
POSZTTRANSZLÁCIÓS FOLYAMATAINAK ÉS
MECHANIZMUSAINAK VIZSGÁLATA (GLIKOZILÁLÁS)
GYAKORLATI CÉLOK ALKALMAZOTT
KUTATÁS DIAGNOSZTIKA - PROGNOSZTIKA - MARKEREK
(PL. DAGANATOS MEGBETEGEDÉSEK FELISMERÉSE)
6

• ELVÁLASZTÁSTUDOMÁNY
• ELVÁLASZTÁSI FELADATOK
• MINTA ELOKÉSZITÉS
• ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI
• MÓDSZEREK
• EGYIDEJÜ ÉS ÖSSZEHANGOLT ALKALMAZÁS
• MULTIMODÁLIS MULTIDIMENZIONÁLIS
• ANALITIKAI PREPARATIV

7
(No Transcript)
8

• AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI RENDSZER

9

ANALITICA EST ANCILLA CHEMIAE ?
Paradigma váltás a BIOANALITIKÁBAN
10

• MINTA ELOKÉSZITÉS
• ÁLTALÁNOS SZEMPONTOK ÉS KÖVETELMÉNYEK
• A MINTA JELLEMZÉSE
• A VIZSGÁLANDÓ VEGYÜLET(EK)
  TULAJDONSÁGAINAK ISMERETE
• MOLEKULATÖMEG, ALAK,
  MINOSÉG
• (Globuláris-fibrilláris,
  aggregáció, flexibilitás, belso viszkozitás),
• SZERKEZET, FUNKCIONÁLIS
  CSOPORTOK,
• OLDÉKONYSÁG,
  SZOLVATÁCIÓ-HIDRATÁCIÓ, POLARITÁS, pKA,
  pKI
• HIDRODINAMIKAI JELLEMZOK
  (Diffúziós állandó, Stokes-rádiusz),
• SPEKTROSZKÓPIAI ADATOK,
  DETEKTÁLHATÓSÁG,
• BIOLÓGIAI AKTIVITÁS
  (Enzimatikus, élettani, stb.)
• STABILITÁS (Fény, Ho, Ido)
• ELEKTROKÉMIAI TULAJDONSÁGOK
  (pI)
• IRODALMI ADATOK HASONLÓ
  SZERKEZETÜ ANYAGOKRA (ADATBÁZIS)

11

• MINTA ELOKÉSZITÉS
• A BIOLÓGIAI KÖRNYEZET (MATRIX) JELLEGE
• Kinyerheto-e a vizsgálandó anyag a
  változatlan mátrixból,
• Felszabadítható-e a szilárd
  fázisból,
• Csökkentheto-e a mátrix
  kötésének erossége,
• (pl. higítás, pH, ionerosség,
  stb. változtatásával)
• Vannak-e jelen potenciális
  interferáló vegyületek.
• AZ INTERFERÁLÓ ANYAGOK
  VIZSGÁLATA
• A minta jellemzéséhez hasonlóan.

12

• MINTA ELOKÉSZITÉS
• A MINTA ELOKÉSZÍTÉS IGÉNYEI
• CLEAN UP - SELECTIVE
  ENRICHMENT
• TISZTITÁS IGÉNYE felmerül-e ?
• (Specifikus detektálhatóság,
  interferáló anyagok?)
• TÖMÉNYITÉS IGÉNYE felmerül-e ?
  
• (Oldékonyság, detektálhatóság,
  ?)
• OLDÓSZER CSERE (váltás) igénye
  felmerül-e ?
• - Alkalmas-e az eluáló
  oldószer(elegy) a HPLC-re ?
• - Alkalmas-e a vizes elúció a
  detektálásnál ?
• - Szükséges-e más (illékony)
  oldószer alkalmazása ?

13
(No Transcript)
14

• MINTA ELOKÉSZITÉS
• A MINTA ELOKÉSZITÉS
  MÜVELETEI
• FIZIKAI-MECHANIKAI MÜVELETEK
• MINTAVÉTEL
• (Random, statisztikai,
  anatómiai heterogenitás, stb.)
• APRITÁS, ÖRLÉS, HOMOGENIZÁLÁS
• (Késes, Grinder, Potter,
  Dounce, Ultrahang)
• SZITÁLÁS, SZÜRÉS, ULTRASZÜRÉS,
  DIALIZIS
• CENTRIFUGÁLÁS - ULTRACENTRIFUGÁLÁS
• KIVONÁS (EXTRAKCIÓ), TÖMÉNYITÉS, SZÁRITÁS

15
(No Transcript)
16
(No Transcript)
17

• MINTA ELOKÉSZITÉS
• A MINTA ELOKÉSZITÉS
  MÜVELETEI
• KÉMIAI MÜVELETEK
• HIGITÁS, IONEROSSÉG, pH VÁLTOZTATÁS
• HIDROLIZIS (Savas, lúgos, enzimatikus)
• SZÁRMAZÉK KÉPZÉS
• (Kromofor csoportok,
  polaritás változtatás, stb.)
• ADALÉKANYAGOK
• (Ion-pár képzés, detergensek,
  polaritás változtatás)
• SPECIÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK
• (Immuno-affinitás,
  zárvány-fém komplex)

18

• MINTA ELOKÉSZÍTÉS
• AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZER
  KIVÁLASZTÁSA
• 
  ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK
• EGYSZERU ELVÁLASZTÁSI
  ELJÁRÁSOK
• KROMATOGRÁFIÁS
  ELVÁLASZTÁSI MÓDSZEREK
• ELVÁLASZTÁSI MÜVELETEK
  ELEKTROMOS EROTÉRBEN
• 
  Elektroforézis - Elektromigráció
• ELVÁLASZTÁSI MÜVELETEK
  GRAVITÁCIÓS EROTÉRBEN
  Centrifugálás Ultracentrifugálás

19

• MINTA ELOKÉSZÍTÉS
• EGYSZERU ELVÁLASZTÁSI ELJÁRÁSOK
• SZITÁLÁS, SZURÉS, ULTRA(MOLEKULA)SZURÉS,
  DIALIZIS
• SZÁRÍTÁS (BEPÁRLÁS, VÁKUUM
  BEPÁRLÁS, FAGYASZTVA SZÁRÍTÁS)
• SZÉTKRISTÁLYOSÍTÁS (pl.
  diasztereomer sópárok)
• KIVONÁS EXTRAKCIÓ
• GÁZ-GOZ FÁZISÚ EXTRAKCIÓ
• Vákuum, vagy vízgoz desztilláció,
  Goztér (head space) analizis,
• Vivogázzal (N2 Ar,
  He), Kriocsapdával (purge and trap)
• FOLYADÉK-FOLYADÉK FÁZISÚ
  EXTRAKCIÓ
• FOLYADÉK-SZILÁRD
  FÁZISÚ EXTRAKCIÓ
• SZUPERKRITIKUS ÁLLAPOTÚ (CO2,
  CS2) EXTRAKCIÓ

20

• MINTA ELOKÉSZÍTÉS
• KIVONÁS EXTRAKCIÓ
• FOLYADÉK-FOLYADÉK FÁZISÚ
  EXTRAKCIÓ
• Megoszlási egyensúly létrehozása
• nem elegyedo
  oldószer (vizes!) fázisok között
• Szakaszos (pl.
  kirázás választótölcsérben),
• Folyamatos
  (ellenáramú, counter current) technikák
• FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ
• Oldószeres, sós,
  savas kicsapás (precipitáció)
• Szilárd fázisból történo extrakció
• Soxhlet
  eljárás,
• Szilárd fázison
  történo extrakció
• SPE (Solid
  Phase Extraction)

21
AZ FOLYAMATOS ELLENÁRAMÚ FOLYADÉK-FOLYADÉK FÁZISÚ
EXTRAKCIÓ
Countercurrent Flow-Through Coil Centrifuge (Ito
et al. 1971)
22

• MINTA ELOKÉSZÍTÉS
• FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ
• OLDÓSZERES, SÓS, SAVAS KICSAPÁS
• (PRECIPITÁCIÓ BIOLÓGIAI MINTÁK)
• MeOH, CHCl3-MeOH, CH3CN, PrOH,
  Aceton, Éter
• EtOH (Cohn-féle
  frakcionálás), hodenaturáció
• (NH4)2SO4, Na2SO4,
  PEG, kaprilsav, Rivanol, stb.
• Triklór ecetsav,
  perklórsav, foszforwolframsav,
• szulfoszalicilsav,

23
SOXHLET KÉSZÜLÉK
ELLENÁRAMÚ EXTRAKCIÓ
24

• MINTA ELOKÉSZÍTÉS
• SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNO EXTRAKCIÓ
• (Solid Phase Extraction, SPE, SPME)

25
(No Transcript)
26

• MINTA ELOKÉSZÍTÉS
• SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNO EXTRAKCIÓ
• (Solid Phase Extraction, SPE, SPME)
• AZ ÁLLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA
• (TÖLTET, CARTRIDGE)
• A MINTA KÖLCSÖNHATÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL
  ?
• (C - SiO2 - Al2O3 CN OH NH IEX RP
  2-18 HIC SEC AFF )
• RETENCIÓS ADATOK (HPLC)?
• SZELEKTIVITÁS AZ ÁLLÓ FÁZISRA?
• ÁLLÓ FÁZIS HIDRODINAMIKAI JELLEMZOI
• (SZEMCSE MÉRET, ELOSZLÁS, ALAK, TÖLTÉS MINOSÉGE)

27

• SZERVES MINTA (MWlt2000Da)
• OLDÓDIK
• SZERVES OLDÓSZERBEN
  VÍZBEN
• /
  \
  / \
• POLÁRIS KÖZEPESEN APOLÁRIS IONOS
  NEM IONOS (ION-PÁR)
• MeOH Hexán
  KATIONOS ANIONOS POLÁRIS KÖZEPESEN APOLÁRIS
• CH3CN Heptán
• EtAc CHCl3
  
• NPC ADS RPC
  IEX NPC ADS RPC
• CIANO KIESELGUHR C18
  CIANO AMINO CIANO
  SíOH C18
• KIESELGEL
• DIOL SiOH
  C8 -COOH NH2/NH
  DIOL FLORISIL C8
• AMINO FLORISIL CIKLO
  -SO3H -NR3 -NH2/NH
  Al2O3 CIKLO

28

• MINTA ELOKÉSZÍTÉS
• SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNO EXTRAKCIÓ
• (Solid Phase Extraction, SPE, SPME)
• AZ ÁRAMLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA
• (MINTA OLDÓSZERE, MOSÓFOLYADÉK, ELUENS)
• A MINTA ÖSSZETEVOINEK
  OLDÉKONYSÁGA
• KÖLCSÖNHATÁSOK LÉTREHOZÁSA AZ
  ÁLLÓ FÁZISSAL
• ÉS/VAGY
  MEGBONTÁSA
• DIFFERENCIÁLÁS LEHETOSÉGE (OLDÓSZER
  ELEGYEK)

29

• SZERVES MINTA (MWgt2000Da)
• 
  OLDÓDIK
• SZERVES OLDÓSZERBEN
  VÍZBEN
• 
  / \
• 
  IONOS NEM-IONOS
• /
  \ Ion-pár képzo
  
  
• 
  KATIONOS ANIONOS
• RPC
• WP-BUTIL (C4) IEX SEC
  IEX WP-BUTIL (C4) SEC
• 
  WP-COOH WP-PEI
  
• 
  Sephadex G-25
  Sephadex G-25
• HEXÁN
  HEXÁN
  PUFFER
• METILÉN KLORID VIZES PUFFEREK
  METILÉN KLORID
• ACETONITRIL
  ACETONITRIL
• ACETON
  ACETON
• METANOL VIZ
  METANOL - VIZ

30

• MINTA ELOKÉSZÍTÉS
• SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNO EXTRAKCIÓ
• (Solid Phase Extraction, SPE, SPME)
• A SPE ALKALMAZHATÓSÁGÁNAK ÁLTALÁNOS SZABÁLYA
• AZ ÁLLÓ FÁZIS
• EROSEN POLÁRIS
  GYENGÉN POLÁRIS-APOLÁRIS
• SiO2
  C18
• A MINTA
• OLDÓSZERE GYENGÉN POLÁRIS
  EROSEN POLÁRIS
• (MOSÓFOLYADÉK) (HEXÁN, THF)
  (H2O, AcOH, TFA)
• AZ ELUÁLÓ EROSEN POLÁRIS
  APOLÁRIS
• OLDÓSZER (VIZES PUFFER, AcOH, MeOH)
  (MeOH, ACN)
• A MINTA
  ELOSZÖR A
• ÖSSZETEVOINEK LEGAPOLÁRISABB
  LEGPOLÁRISABB

31
Minta elokészítés Extrelut NT-vel
3. Szerves oldószer felvitele (vízzel nem
elegyedo)
1. Extrelut NT
2. Vizes alapú minta felvitele
4. Elúció Lipofil komponensek kinyerése a mintából
32
LiChrospher ADS Alkyl Diol Silica LC-integrált
(on-line) mintaelokészítéshez

• Kettos módosítással készült szilika részecskék
  (25 µm)
• Hidrofil külso felület DIOL módosítással
• biokompatibilis diol borítás
• elkerülheto a proteinek/nukleinsavak
  irreverzibilis adszorpciója a szilika részecskék
  felületén
• nincs oszlop eltömodés
• nem növekszik a nyomás
• Hidrofób belso felület pórusfalak fordított
  fázisú módosítással
• (RP- 4, RP- 8 ill. RP-18)
• a retenciós tulajdonságok az analit polaritásához
  igazíthatók
• a pórusok csak kis méretu analitok számára
  hozzáférhetok
• (MW lt 15,000 Dalton)
• nagyobb makromolekulák (pl. proteinek,
  nukleinsavak) a pórusokon kívül maradnak és
  kvantitatívan eltávolíthatók

33
Makromolekuláris összetevok (protein, nukleinsav)
Diol felületi réteg
Kismolekulájú apoláris összetevok
Apoláris belso szerkezet
LiChrospher ? ADS
34
Többrétegu héjszerkezetu kromatográfiás
állófázis (C18) vázlatos szerkezete és pásztázó
elektronmikroszkópos (SEM) képe.
35

• MINTA ELOKÉSZÍTÉS
• SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ
• A SPE MÓDSZER ELOZETES VIZSGÁLATA
• SORÁN MEG KELL HATÁROZNI
• AZ EXTRAKCIÓ OPTIMÁLIS MÓDJÁT,
• A MÁTRIX MÓDOSÍTÁSÁNAK LEHETOSÉGÉT,
• A MEGFELELONEK TARTOTT ÁLLÓ FÁZIST
• (TÖLTET, SZORBENS),
• A MEGFELELONEK TARTOTT OLDÓSZERELEGYEKET
• (MOSÓ-ELUÁLÓ),
• A MINTA (MINIMÁLIS-SZÜKSÉGES) TÉRFOGATÁT,
• AZ ÁLLÓ FÁZIS MÉRETÉT

36

• MINTA ELOKÉSZÍTÉS
• SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ
• A SPE MÓDSZER OPTIMÁLÁSA
• REPRODUKÁLHATÓSÁG, VISSZANYERÉS
• REFERENCIA VEGYÜLETEKKEL,
• HATÁSOSSÁG MATRIX NÉLKÜL ÉS KOMPLEX
• (BIOLÓGIAI) RENDSZERBEN,
• INTERFERÁLÓ ANYAGOK HATÁSÁNAK
  MODELLEZÉSE,
• VALIDÁLÁS BELSO ÉS KÜLSO STANDARDOKKAL
• (ROBOSZTUSSÁG)
• HIBA, SZÓRÁS, ÉRZÉKENYSÉG, KIMUTATHATÓSÁGI
  HATÁR, SPECIFICITÁS MEGHATÁROZÁSA,
• KÖLTSÉGKIHATÁS, GAZDASÁGOSSÁG BECSLÉSE.

37
A FOLCH-FÉLE EXTRAKCIÓ Apoláris (lipidek-zsírok)
vegyületekre VIZES FÁZISÚ MINTA
1 TÉRFOGAT (VÉRSZÉRUM,
SZÖVET HOMOGENIZÁTUM) KLOROFORM-METANOL (11)
16 FORRÁSIG HEVÍTÉS KLOROFORM
8 SZURÉS
CENTRIFUGÁLÁS VÁLASZTÓTÖLCSÉRBEN 1 KCl 0,2
TÉRFOGAT ELVÁLASZTÁS KLOROFORM (ALSÓ) FÁZIS
BEPÁRLÁSA ANALIZIS (TLC, HPLC)
VIZES MeOH
CHCl3
38
POLÁRIS ÉS APOLÁRIS LIPIDEK (ZSÍROK) TLC
ANALIZISE EGYDIMENZIÓS KÉT LÉPÉSES ELVÁLASZTÁS
1. - LÉPÉSBEN CHCl3-MeOH-AcOH (35-25-4)
2. - LÉPÉSBEN HEXÁN-ÉTER-AcOH (85-15-3)
ELOHIVÁS PMS
39
MINTAELOKÉSZÍTÉS SPE TERMÉSZETES POLI (OLIGO)
AMINOK MEGHATÁROZÁSA
Szövetek, sejtek, biológiai folyadékok
Homogenizálás foszfát pufferben, pH 7,2 Kicsapás
7 -os HCIO4 Centrifugálás ? felülúszó
Tisztítás és elofrakcionálás DOWEX 50X-8
Danzilezés ( 60 - 540C) Aceton
elpárologtatása Extrakció toluollal Szárazra
párlás, Oldás metanolban
HPLC
40
A t-RNS SZERKEZETE
PSEUDO-URIDIN MEGHATÁROZÁSA HUMÁN VIZELETBEN
41

• MINTA ELOKÉSZÍTÉS SPE
• NUKLEOZIDOK (Ade, Cyt, Gua, Uri, ?-Uri)
  ELVÁLASZTÁSA BORONÁT AFFINITÁSI FÁZISON

0,1M HCOOH
NH4Ac puffer pH8,8
HPLC
42
MINTAELOKÉSZÍTÉS - SPE
HUMÁN SZÉRUM SAVANYÚ ALFA-1-GLIKOPROTEIN (AGP)
IZOLÁLÁSA ÉS TISZTÍTÁSA
HUMÁN SZÉRUM
?
NEM ELEGYEDO FÁZISÚ OLDÓSZERES EXTRAKCIÓ KLOROFORM
-METANOL-VÍZ CENTRIFUGÁLÁS
?
VIZES-METANOLOS FÁZISBÓL FEHÉRJÉK KICSAPÁSA
ETANOLLAL CENTRIFUGÁLÁS
?
FESTÉK-LIGAND (Cibacron Blue) AFFINITÁSI
KROMATOGRÁFIA
43
(No Transcript)
44
(No Transcript)
45
(No Transcript)