Universit

1
Université Dr Moulay Tahar de SaidaFaculté des
Sciences TechnologiesDépartement de Biologie

• Interaction protéine -ligand
• caractérisation des sites de fixation.

2

• Introduction
• La quantification des sites de fixation d'un
  ligand sur une protéine nécessite en général la
  mesure de la concentration de ligand lié à la
  protéine à l'équilibre thermodynamique.
• C'est ce que sera envisagé dans ce chapitre.
• I- Rappel théorique
• Protéine à un site de fixation
• La fixation à l'équilibre d'un ligand sur une
  protéine qui possède un site de fixation pour ce
  ligand est régie par un équilibre thermodynamique
  
• K1
• P L P-L
  PL/P-L K-1/K1 Kd
• K-1
• P concentration de la protéine libre,
• L concentration de ligand libre,
• P-L concentration de la protéine complexée.

3
Ces 3 concentrations étant définies lorsque
l'équilibre thermodynamique est réalisé. En
utilisant la relation de conservation de la
protéine (Pt P P-L) on en déduit que
P-L

• dépend de Pt, de Kd et de la concentration de
  ligand libre selon une loi hyperbolique
• P-L Pt x (L/KdL)
• On parle alors d'une saturation Michaelienne (par
  analogie avec l'équation de Michaelis donné pour
  la vitesse d'une réaction enzymatique).
• L'expression de P-L complexe formé, est
  constituée de deux termes indépendants
• Pt concentration totale de la protéine

• (L/KdL) ne dépend que du rapport L/Kd
  qui varie entre 0 et 1, et renseigne sur le degré
  de saturation de la protéine, on l'appelle la
  fonction de saturation Ÿ. Sa valeur est égale à
  0,5 (demi-saturation) quand la L libre (L0,5)
  est égale à Kd.

4
Remarque Lorsque l'on est présence d'un
équilibre plus complexe (la protéine libre ou la
protéine complexée pouvant exister sous
différentes formes en équilibre les unes avec les
autres) la fonction de saturation présente une
expression similaire, mais le terme Kd, qui
correspond toujours à L0,5 , représente alors
la constante d'équilibre apparente que l'on peut
définir entre le ligand libre, la somme des
différentes espèces de protéine libre et la somme
des différentes espèces complexées au ligand
Kd (Sprotéine libre)xL
libre/Sprotéine complexée (équation de
départ)
5

• Protéines à plusieurs sites de fixation pour un
  ligand
• Si une protéine possède plusieurs sites de
  fixation pour un ligand, ces sites peuvent être
  indépendants (la fixation du ligand sur un site
  étant indépendante de l'état de saturation des
  autres sites ) ou dépendants.
• a) Sites indépendants et équivalents
• Si une protéine possède n sites de fixation
  équivalents, la relation d'équilibre est vérifiée
  au niveau des sites
• sites libres L/sites occupés Kd
• Kd constante de dissociation microscopique ou
  intrinsèque.

En faisant intervenir la concentration des sites
totaux, qui est égale à n fois la concentration
de la protéine sites occupés sites
totaux x L/(KdL) nPtx L/(KdL) n
Pt Ÿ.
6
La fonction de saturation de l'ensemble des sites
est égale à la fonction de saturation de chacun
des sites. On définit aussi V, le nombre moyen de
sites occupés par protéine V
sites occupés/Pt n L/(KdL) n ý.
La concentration de ligand lié est égale à la
concentration de sites occupés. Elle augmente
avec la concentration de ligand libre selon une
loi hyperbolique pour atteindre une valeur limite
quand tous les sites sont occupés
ligand lié ligand liémax .
L/(KdL). ligand lié et ligand liémax
sont souvent appelées B et Bmax respectivement (B
vient de l'anglais "bound" qui signifie lié)
B Bmax .
L/(KdL).
7
c) Fixations spécifiques et non spécifiques
Une fixation non spécifique est observée en
général lorsque l'on étudie la fixation de
ligands sur des préparations membraneuse, est
définie comme une fixation sur des sites très
nombreux mais de très mauvaises affinité pour le
ligand. Elle s'oppose à la fixation spécifique,
qui a lieu sur un nombre limité de sites et avec
une bien meilleure affinité. La constante de
dissociation des sites non spécifiques est très
grande devant la concentration de ligand libre
utilisée. Avec cette approximation, la
concentration du ligand aux sites non spécifiques
est proportionnelle à la concentration de ligand
libre utilisé, avec le facteur de
proportionnalité Knon spécifique. Lorsque l'on
est en présence de fixation non spécifique et de
fixation spécifique sur une seule classe de
sites, la courbe de la concentration de ligand
lié en fonction de la concentration de ligand
libre est la somme d'une droite et d'une
hyperbole ligand lié Bmax
L/(KdL) Knon spécifique L.
8

• L'évaluation de la fixation non spécifique se
  fait le plus souvent en utilisant, outre le
  ligand radioactif qui se fixe avec une bonne
  affinité sur les sites spécifiques étudiés, un
  ligand non radioactif qui lui, aussi, se fixe
  avec une bonne affinité sur les sites spécifiques
  et avec une très mauvaise affinité sur les sites
  non spécifiques.
• Lorsqu'il est utilisé en large excès devant le
  ligand radioactif, son effet inhibiteur
  compétitif se manifeste seulement vis-à-vis des
  sites spécifiques.
• Protéine ? ? en large excès
  . mesure la fixation non
• 
  spécifique
  par la R.

• Lorsque le ligand R (?) est utilisé seul, la
  fixation observée est égale à l'ensemble de
  fixation spécifique et non spécifique on
  l'appelle fixation totale.

9

• Lorsque la fixation de ligand R est mesurée en
  présence du compétiteur non R (?) en excès, la
  fixation spécifique du ligand R devient
  négligeable à cause de l'effet de compétition (on
  dit que le ligand compétiteur "déplace" le ligand
  R). La fixation du ligand R que l'on mesure est
  alors égale à la seule fixation non spécifique.
• Fixation spécifique fixation
  totale - fixation non spécifique

Expériences de saturation de la liaison à
l'équilibre - Notions de Kd et de Bmax
Principe Il s'agit de mesurer la liaison
spécifique à l'équilibre, lors de l'incubation de
concentrations croissantes de ligand radioactif
(par ex. 10-12 à 10-5 M), avec une quantité
fixe de récepteur (par exemple 100000 cellules
entières exprimant des récepteurs, ou bien 10 ng
d'unepréparationdemembranescellulaires
10
II Analyse des données expérimentales
Lorsque les concentrations de ligand lié sont
connues pour différentes concentrations de ligand
libre, l'analyse mathématique permet de mettre en
évidence que l'on est en présence d'une ou
plusieurs lois hyperboliques (et donc que
l'interaction implique l'existence d'un ou de
plusieurs équilibres ) et de déterminer le nombre
de sites de fixation et leurs constantes de
dissociation. Le nombre de sites de fixation se
déduit de la concentration maximale de ligand que
l'on peut lier (tous les sites étant alors
occupés). Si Pt la concentration de
protéine, est connue, on peut déterminer n, le
nombre de sites de fixation par molécule de
protéine. Mais on peut aussi bien déterminer un
nombre de sites par cellule, ou de moles de
ligand lié par mg de protéine.
11
1) Sites équivalents La concentration de
ligand lié suit une loi hyperbolique en fonction
de la concentration de ligand libre. Plusieurs
méthodes d'analyse des hyperboles existent. Les
méthodes de linéarisation permettent de vérifier
graphiquement que l'on est en présence d'une
simple hyperbole, et de déterminer les paramètres
qui la caractérisent.

• Les deux représentations les plus couramment
  utilisées ont été décrites initialement pour
  lineariser l'expression de (ligand lié/Pt)
  en fonction de L
• - Représentation de Klotz 1/V 1/n (1/n
  Kd/L).
• Représentation de Scatchard V/L n/Kd -
  V/Kd.
• Tout paramètre proportionnel à V peut être
  utilisé dans ces représentations, la
  signification des intersections avec les axes des
  abscisses et des ordonnées étant modifiée. En
  particulier, on utilise souvent la représentation
  de " Scatchard" pour linéariser l'équation de
  ligand lié en fonction de L
• ligand lié/L
  ligand liémax/Kd - ligand lié/Kd.

12
2) Sites indépendants et non équivalents La
représentation de Scatchard n'est plus linéaire,
et il est très difficile de déterminer les
valeurs de Bmaxi et de Kdi par des méthodes
graphiques. Le principe d'une telle analyse peut
se résumer ainsi pour une concentration donnée
de ligand libre, le ligand lié est la somme du
ligand lié à chaque classe de sites. Dans la
représentation de Scatchard, les données
correspondent à la fixation sur une classe de
sites s'alignent sur une droite caractéristique
de la linéarisation de l'hyperbole. L'ensemble
des points correspondent à une même concentration
de ligand libre L et à différentes valeurs de
ligand lié s'alignent, quant à eux, sur une
droite passant par l'origine et de pente 1/L
déterminer à partir d'une représentation de
Scatchard non linéaire, les paramètres de
fixation sur chaque classe de sites consiste donc
à définir les droites correspondent à chacune de
ces classes qui permettent de retrouver la courbe
originale lorsque l'on calcule, pour chaque
concentration de ligand libre, la somme des
concentrations de ligand lié à chaque classe de
sites.
13
binding Principe Marquer les récepteurs par
un ligand radioactif et étudier la cinétique de
la réaction ligand - récepteur en suivant la
quantité de ligand radioactif fixé. Réalisé sur
des préparations subcellulaires (par ex. les
membranes).
Incubation ligand radioactif (L) avec le
récepteur R (par ex sur des mb) Séparation on
élimine le marqueur libre par filtration Mesure
radioactivité du marqueur lié
14
Méthode de binding on mesure la fixation
totale spécifique sur le récepteur non
spécifique sur dautres composants
membranaires On utilise un ligand froid en excès
qui bloque laccès aux sites spécifiques - mais
pas aux non spécifiques - pour le ligand marqué
15
Détermination de la fixation spécifique par
méthode de saturation 1. Préparation riche en
récepteurs radioligand en concentration
croissante liaison totale 2. Préparation riche
en récepteurs ligand froid en surcharge
radioligand en concentration croissante liaison
non spécifique 3. On déduit la liaison spécifique
Figure1 représentation de la liaison en fonction
de la concentration initiale en ligand
16
Figure 2 représentation de la liaison
spécifique en fonction du log de la concentration
initiale en ligand.
17

• RL RL concentration de radioligand lié
  de manière spécifique
• L L concentration de radioligand libre.

Ainsi, la représentation de RL (axe des
ordonnées, y) en fonction de L (axe des
abcisses, x) est une hyperbole
Figure 3 RL f ( L )
18
Quantifification Relation de Scatchard permet
une détermination plus précise de KD et
Bmax Ordonnée ligand lié (LR) / ligand libre
(L) Abscisse ligand lié (LR) KD (Lx
(Bmax - LR))/LR LR (Lx (Bmax - LR))/ KD en
développant et en simplifiant LR (Bmax x L)
/ (L KD) en réarrangeant LR / L (-1 / KD)
LR (Bmax / KD) soit lié / libre (-1 / KD)
lié (Bmax / KD) Y ax
b

• Unités
• Axe des x et des y même unité cpm nombre de
  sites / cellule fmol / mg de protéines. 
• Le Kd s'exprime en M (mol / l), souvent en nM ou
  pM.
• Le Bmax s'exprime en nombre de sites de
  liaison/cellule ou en fmol/mg de protéines.

Figure 4 Représentation selon Scatchard B/F
f (B).
19

• Expériences de déplacement de la liaison à
  l'équilibre - Notions d'IC50 et de Ki
  Principe
• C'est la mesure de la liaison spécifique à
  l'équilibre, d'une concentration donnée (en
  général égale au Kd) en ligand radiomarqué en
  présence d'une concentration variable et
  croissante de ligand froid (par ex. 10-12 à
  10-5 M). Le ligand froid entre en compétition
  avec le ligand radioactif pour sa liaison au
  récepteur, c'est pourquoi on peut parler de
  compétition de la liaison à l'équilibre
• Cette technique permet de démontrer qu'un ligand
  froid, se lie à un récepteur.
• d'étudier la liaison d'un ligand de faible
  affinité pour un récepteur (il est plus facile de
  disposer d'un ligand froid en grande quantité,
  que d'un ligand radiomarqué)

20
Figure 5 Représentation de la liaison totale en
fonction du log de la concentration en ligand
compétiteur froid. Axe des y cpm nombre de
sites / cellule fmol / mg de protéines. NB
la liaison totale n'est pas égale au Bmax car la
concentration en radioligand n'est pas saturante.

21
Expériences de compétition de la liaison, à
l'équilibre ( IC50 , Ki )
Figure 6 Représentation de la liaison spécifique
en fonction du log de la concentration en ligand
compétiteur froid.

• 100 liaison spécifique en l'absence de
  compétiteur froid. 
• 50 concentration en compétiteur froid qui
  déplace 50 de la liaison spécifique en ligand
  radiomarqué ( IC50).
• 0 liaison spécifique en présence d'un excès
  de compétiteur froid.

22
Equation de Cheng et Prusoff

• Cheng et Prusoff ont déterminé en 1973 la
  relation qu'il existe entre le Kd, le Ki et
  l'IC50
• Ki constante de dissociation à l'équilibre pour
  le compétiteur froid.
• Kd constante de dissociation à l'équilibre pour
  le ligand radiomarqué (affinité).
• L L concentration de radioligand libre.
• Kd représente donc bien la concentration en
  compétiteur froid qui se lie à 50 des sites
  récepteurs

23

• III- Approches expérimentales
• Mesure des concentrations de ligand lié et de
  ligand libre
• La concentration des sites de fixation demande en
  général la mesure des concentrations de ligand
  lié et de ligand libre. Plusieurs approches
  expérimentales sont possibles elles utilisent en
  général la séparation physique du ligand libre et
  du ligand lié à la protéine.
• Ainsi lorsque l'on étudie la fixation d'un ligand
  sur des protéines membraneuse, on peut
  centrifuger (ou filtrer) le mélange. Le ligand
  libre se retrouve dans le surnageant (ou le
  filtrat), le ligand lié dans le culot (ou le
  filtre).
• Si l'on travaille avec des protéines solubles, et
  que l'on étudie la fixation de petits ligands, on
  peut utiliser la filtration sur tamis moléculaire
  ou la dialyse à l'équilibre.
• La filtration sur une colonne de tamis
  moléculaire utilise les différences de migration
  des grosses molécules (la protéine avec ou sans
  ligand lié) et des petites molécules (le ligand
  libre).

24

• Dans le cas de la dialyse à l'équilibre, le
  ligand libre est capable de diffuser librement à
  travers la membrane de dialyse, alors que ligand
  lié à la protéine ne peut pas traverser la
  membrane. Une variante de cette méthode est la
  mesure de la vitesse de dialyse à travers une
  membrane cette vitesse est proportionnelle à la
  ligand libre dans la chambre de dialyse.
• La détermination de la ligand lié et de ligand
  libre peut se faire indirectement, en étudiant
  un paramètre expérimental qui varie lorsque le
  ligand passe de l'état libre à l'état lié.
• Exemple la fluorescence d'un coenzyme libre peut
  être comparée à la fluorescence de ce coenzyme
  lorsqu'il est en présence d'une concentration
  saturante d'apoenzyme. Connaissant ces deux
  paramètres, on peut, pour différentes
  concentrations d'apoenzyme calculer la
  concentration de coenzyme libre et de coenzyme
  lié.