Folie 1

1
Bazofilný degranulacný test na prietokovom
cytometri metodické aspekty

Bobovcák M., Klinické laboratórium VVÚCHP, Nová
Polianka, Vysoké Tatry , Slovensko
2
BDT / BAT funkcný test - FC (Saint-Laudy
1994) - Alergie - Typ I hypersenzitivita
(IgE) - Pseudoalergie - nonIgE, komplement, IgG,
TypII,III , auto anti- IgE - Nezachytáva Typ IV
bunkami sprostredkovaná hypersenzitivita
Princíp
Periférne Leu (WB) stimulans v aktivacnom
pufri Inkubácia detekcia expresie CD63(gp53)
na FC identifikovaných bazofiloch
Basotest Orpegen
FlowCast Bühlmann
BD FastImmune BD
100 ul WB heparín
100 ul WB heparín
Izolované Leu 50 ul ACD, EDTA
Vzorka
BSB/Stimul
20/100 ul
0/50 ul
0/20ul
40 min
10 pred/20 min
10 15 min
Inkubácia
N-FMLP
FceRI
N-FMLP
Pozitívna K
EDTA?Chlad/ Lýza
Lad / Lýza
Lad or EDTA/ Lýza
Stop/Lýza
CD63-FITC/ IgE-PE
CD63/ CD123/DR
Farbenie
IgE-Fitc/CD63-PE
3
Ciel metodický postup pre optimálny BDT pre
vyšetrenie alergie a pseudoalergií (liecivá)
BDT predanalytická fáza

Pacient vysadenie liekov 14 dní steroidy, 48
hod. anti-histaminika/leukotriény

Odber heparín, štandardizovaný (5-7ml
vacutainer a pod.) do 4 (24?) hod. (sklo, plast,
laminárny box, sedimentácia plnej krvi na
gradiente 1077 3ml/3ml 40-50 min, odpipetované
800 ul plazmy)
Izolované Leu centrifugacne
Mononukleáry gradient
Plazma heparín
Plná krv




Jednoduchost
Nešpecifická StimuláciaTR




Interakcie (Liecivá)
Ery,Tr proteíny
Ery,Tr
Tr
Tr proteíny


Farbenie FC


4
BDT reakcné pomery - postup
Apyrogénne, sterilné, 2 ml skúmavky EPP
/otestovat/ , laminárny box 50 ul -
Stimulacný pufer BSB
(NC), - 1ug/ml a-IgE(De2), 2uM N-
FMLP (PC), - stimulans /
alergén v BSB BSB
20mM HEPES, 5 KCL,133 NaCL, 7 CaCl2, 3.5 MgCl2, 1
mg/ml HSA pH 7,4 (proTK ) 10 ul r
IL3 v BSB 10ng/ml zvyšuje senzitivitu
(literatúra) 50 ul heparínovej plazmy /
KO analyzátor / INKUBÁCIA 37oC, vodný
kúpel 20 min silné alergény (inhalacné,
potraviny... ) 40 min slabé alergény
(liecivá... ) (kontrolný pacient) STOP ladový
kúpel 5 min. FARBENIE protilátkami 25-30 min. na
lade PREMYTIE pufrom WB 0,1 BSA v PBS 1,5
ml RESUSPENDOVANIE 600ul WB AKVIZÍCIA - FC
(300 500 - 1000 bazofilov)

5
Negatívna kontrola BSB do 10 CD63Bazo n30
spontánna stimulácia / vylúcenie
nešpecifickej stimulácie /
n15
CD63 Bazo
6

• Pozitívna kontrola
• Anti IgE(De2) 70-90 CD63Bazo ( 25
  nonresponder)
• N FMLP peptid 30-60 CD63Bazo
• Anti IgEeRI ? - výhodnejšie ako anti IgE (5
  nonresp. Lit.)

NC - pufer
PC a-IgE
CD63 Fitc
CD63 Fitc
SS
SS
7
Stimulans / Alergény
Silné alergény inhalacné, potraviny, latex,
jedy /insekty/

• velmi dobrá korelácia s inými testami aj s BDT z
  plnej krvi u latexu vynikajúca.
• Komercne dostupné pre BDT napr. Bühlmann
  Použitelné Stallergen, Sevapharma ! PNU jednotky
• Kritická 1.cistota /!!!! aditíva ako azid,
  mertiolát, fenoly interakcia s bielkovinami,
  trombo, ery...
• 2.koncentrácia v teste
  musí byt predtestovaná !!! S ohladom
• - na senzitivitu co najvyššie percento
  CD63bazofilov
• - na špecifitu pacient reaguje v závislosti od
  dávky,
• nealergický pacient nereaguje pri danej konc.
  alergénu

Slabé alergény liecivá a pod. nízka odpoved
CD63Bazo

• Senzitivita lepšia pri použití izolovaných
  Leukocytov
• komercne dostupné pre BDT napr. Bühlmann
  literatúra ,
• Kritické!!! Cistota, Koncentrácia - v teste
  využil kontrolu na negatívneho pacienta, pracovat
  vždy dávkovo /najmenej 2 koncentrácie/ a NC v
  duplikáte.
• Interakcie inhibícia BDT, s bunkami a
  bielkovinami
• Použitie originálnych farmák. Vodítko www.
  Bühlmann.com
• Testované u nás
• ACP, Ibuprofen, Penicilín G, V,Amoxicillin
  ,Ciprofloxacin Arduan, Norcuron

8
BDT identifikácia bazofilov
Aktivácia
1.CD203c bazofily, mechanizmus upregulácie
nejasný
2. CD63 bazofily, enzymatická kaskáda pri
aktivácii a degranulácii vedie k externalizácii
intracelulárnych komplexov s transmembr. CD63
Protilátky
aCD203c-PE ( 97A6) bazofily,mastocyty,
megakaryoc. CD34bb. - Immunotech
aCD123 - PE (IL3Ra, 9F5) bazo, mono, Eo,
dendritické bb. - BD
aHLA DR- PCP (1.243, Bazo- Low SS, Eo- High SS),
(B, Mono, dendrit.bb.) - BD
aCD63 FITC (gp53, H5C6) akt. bazo, akt.
Trombo, Monocyty,MF -PharMingen
aCD45 PC7 Pan Leu Trombo- , Ery -
-Immunotech
9
63 / 203c / 45 versus 63 / 123 / DR / 45
WB
CD203c PE
CD203c PE 45
CD203c PE
WB
Plazma
SS
SS
SS
CD203c PE 45
CD123 PE 45
CD123 PE 45 DR-
Plazma
Plazma
Plazma
SS
SS
SS
10
Stratégia gatingu 63-FITC/123-PE/HLADR-PCP/45-PC7
CD123 PE
DR-PCP
CD45 PC7
1
2
Bazo
Leu Live Gate
DR-PCP
SS
SS
3
FW
CD63 Fitc
CD123 PE
Bazo
Aktivované Bazo
SS
SS
SS
Live Gating CD45, Low SS, kompenzácia !!!
11
Pozitivita vs Negativita
CD63 Fitc
CD63 Fitc
CD63 Fitc
TopCast 666 bazo 91,0
PC a-IgE 559 bazo 94,6
NC 514 bazo 2,0
SS
SS
SS
1
1
1
CD63 Fitc
CD63 Fitc
CD63 Fitc
PC FMLP 497 bazo 35
PC FMLP 754 bazo 7
PC IgE 700 bazo 8
SS
SS
SS
3
3
2
Zodac, Flixonase, Seretide
12
Liecivá , Interakcia trombocytov
CD63 Fitc
CD63 Fitc
CD63 Fitc
NC 609 bazo 15
Ibuprofen 742 bazo 7
ACP 973 bazo 18
SS
SS
SS
1
1
1
Ibuprofen 345 bazo 14
CD62P Fitc 45
CD45 PC7
CD63 Fitc
1
0,4
5
SS
SS
2
Trombocyty, interakcia s liekmi, koagregáty s
Leu, aktivácia
13
Reprodukovatelnost IntraAssay CV
CD63 Bazo
Negatívne kontroly, triplikáty, n10 - CV 15,9
Pozitívne kontroly n5, duplikáty CV 4,3
Hodnotenie silné alergény CD63
Bazofilov NClt10, PC(IgE) 70-90, PC(FMLP)
30-70, Stimul gt 20
Hodnotenie slabé alergény (liecivá) Stimulacný
index SIakt.Bazo Test / akt.Bazo NC Negatívne
SIlt1,3 Dubiózne SI 1.3-2,0 Pozitívne
SIgt2,0 Negativita neznamená , že pacient
nezareaguje klinicky ! !dávkový režim, duplikáty,
optimalizovaná cc! !
14
Záver
Prezentovaný Bazofilný degranulacný / aktivacný
test vo vlastnej optimalizovanej modifikácii, v
ktorom sme skombinovali aj niektoré výhody
komercne dostupných testov, je použitelný pre
testovanie hypersenzivity na silnejšie alergény
, slabšie alergény i liecivá, za dodržania
vyššie spomínaných odporúcaní. Je pracovne
nenárocný a lacnejší ako komercné sety.