CTC

1
Prospektive  Pilotstudie zur Prüfung eines
Antikörper-beschichteten Nanodetektors für die
Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTC)
aus dem Blut von Nierenzellkarzinom-Patienten Ger
it Theil1, M. Raschid Hoda1, Kersten Fischer1,
Klaus Lücke2, Paolo Fornara1 1 Klinik und
Poliklinik für Urologie und Nierentransplantations
zentrum, Martin-Luther-Universität
Halle-Wittenberg, 2 Gilupi Inc., Potsdam
Einleitung Der Nanodetektor basiert auf einem 16
cm langen Edelstahldraht (Durchmesser 0,5 mm),
welcher an einem Ende über einen 2,5 cm langen
Bereich mit Gold und einem Hydrogel beschichtet
wurde. Diese Oberfläche ermöglicht eine kovalente
Bindung von Antikörpern, die gegen das humane
Oberflächenantigen EpCAM (Epithelial Cell
Adhesions Molecule) gerichtet sind. Die
prospektive Pilotstudie wurde zur Überprüfung der
Funktionalität des medizinischen Drahtes (FSMW)
in vitro durchgeführt (Abb.1).
Abb. 1 Aufbau des Antikörper-beschich
teten Nanodetektors
Ergebnisse EpCAM-Expression der Primärkulturen
von Nierenzellkarzinomen -
immunzytochemische Untersuchung

Methode Im ersten Teil der Studie wurde die
EpCAM-Expression an Primärkulturen von
Nierenzellkarzinomen (RCC) unterschiedlicher
Tumorentität und unterschiedlichen
Malignitätsgrades immunzytometrisch untersucht
(Abb. 2 und 3). Die folgenden Spiking-Experimente
dienten der Evaluierung des FSMW. Dazu wurden 15
mL EDTA-Blut von gesunden Probanden mit
Primärkulturzellen von Nierenzellkarzinomen
angereichert (12 - 660 RCC-Zellen/mL) und der
Nanodetektor im hämodynamischen Modell
(Fließgeschwindigkeit 2,65 cm/s, 30 min)
angewendet (Abb. 4, Tab. 1). Abschließend wurde
Blut von 13 RCC-Patienten mit gesicherter
Diagnose in unterschiedlichen Tumorstadien
eingesetzt. Das Blut von 2 gesunden Probanden und
eines Patienten mit benigner Nierenerkrankung
diente als Kontrolle (Abb. 5, Tab. 2). Die
Charakterisierung der isolierten RCC-Zellen bzw.
der CTC erfolgte mit anti-pan-CK-FITC und die
Kernlokalisation mit Hoechst 33258.
EpCAM-positive Leukozyten wurden mit der
CD45-APC-Kontrollfärbung identifiziert.
a)
b)

Abb. 2 PFA-fixierte Primärkultur
immunzytochemischer Nachweis von EpCAM mit
anti-EpCAM-FITC und Kernlokalisation durch
Hoechst 33258 a) hellzellige
RCC-45-Zellen (pT3b, G2) , b)
hellzellige RCC-28 (pT1a, G1)

Ergebnisse Ex-vivo-Isolierung von CTC aus
Patientenblut (hämodynamisches Modell)
Abb. 3 EpCAM-Expression der Primärkulturen von
Nierenzellkarzinomen
a)
b)
Ergebnisse Spiking-Experimente (hämodynamischen
Modell)
a)
b)
Abb. 5 Färbung Overlay von anti-pan-CK-FITC-,
anti-CD45-APC-, Hoechst-Kernfärbung. Beispiel für
CTC aus RCC-Patientenblut am FSMW. a) RCC-Patient
7, b) RCC-Patient 1
c)
d)
Tab. 2 Zusammenfassung- FSMW ex-vivo
CTC-Isolierung
Histologie Tumorentität CTC Histologie Tumorentität CTC Histologie CTC
lokal begrenzte Nierentumore lokal begrenzte Nierentumore lokal begrenzte Nierentumore metastasierte Nierentumore metastasierte Nierentumore metastasierte Nierentumore Kontrollgruppe Kontrollgruppe
pT1aG1 hellzellig 2 pT1aG1 papillär 0 Benigne Erkr. 1
pT1aG2 hellzellig 0 pT1G2 hellzellig 5 Gesund 1
pT1aG3 papillär 10 pT3aG3 hellzellig 2 Gesund 0
pT1bG1 papillär 5   hellzellig 3
pT1bG2 papillär 0 pT3aG2 hellzellig 3
pT3aG2 hellzellig 3
pT3bG2-3 hellzellig 7
pT3aG2 chromophil 8
a)
b)
Abb. 4 a) FSMW-gebundene, isolierte
RCC-45-Zellen (hellzellig, pT3b, G2), Färbung mit
pan CK-FITC und anti-CD45-APC
und Kernlokalisation durch Hoechst 33258
b) FSMW-gebundene, isolierte RCC-45-Zellen
(Rasterelektronenmikroskopie)
e)
Tab. 1 Zusammenfassung- Spiking-Experimente
Primärkulturzellen von RCC-n (n Nummer der Zelllinie) Zellzahl/mL Blut Anzahl pan-CK positiver Zellen am FSMW
RCC-45 (hellzellig pT3b) 660 832
RCC-149 (sarkomatoid) 660 0
RCC-53 (hellzellig pT1a) 30 186
RCC-53 (hellzellig pT1a) 15 82
RCC-84 (hellzellig pT1b) 12 2
RCC-63 (hellzellig pT1b) 12 6
RCC-182 (hellzellig pT1b) 12 2
Schlussfolgerung Die untersuchten Tumorentitäten
weisen eine unterschiedlich starke
EpCAM-Expression auf, die beim hellzelligen
Nierenzellkarzinom tendenziell höher ist. Es
konnte gezeigt werden, daß eine ex-vivo
CTC-Isolierung beim RCC mit Hilfe des FSMW
möglich ist. Weiterführende Untersuchungen an
Tumorgewebeproben und Patientenblut sollen die
erhoben Befund untermauern.