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• ana.simonovic_at_ibiss.bg.ac.rs
• IBISS, ???. 2078-431

2
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4
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1700s ?????????? ?????????? ? ???????????? ???????? ?????
1860s ?????????? ????? ? ????????? ?????? ?????? ???????? ?????? ? ?????? ?? ?? ?????????? ???????, ??????? ?????????? ??? ????, ??????? ?? ???????? ?? ???????
1900 ???????? ?????????? ?????? ?? ??????????? ????? ????????????? ????????? ????????? ??????? ????????? ?? ?????????? ????
1922 ??????? ????????? ???????? ?????? ???????? ?????????? ?????????? ??? ??????????
1953 ??????? ????????? ??? ????????? ??????? ??????? ???????? ? ??????????? ?????????
1970s ?????? ?????????? ???????? ?????? ?? ????? ? ????? ? ???????, ????????? ???????
1973 ???????? ???????????? ??????????? ??? ?????? ??????? ?????????? ???????????
1983 ???????? ???? ????????? ???????????? (??) ????? ????? ??????? ?? ????? ??????????
1985 ????????? ? ???? ?? ?????? ???????? ?? ??????, ????????? ? ???????
1986 ???????? ?? ??????? ??????? (EPA, U.S. Environmental Protection Agency) ???????? ??????? ? ?????? ???? ?? ????? ?????? ???????? ?? ?????????
1990 ???? ??????? ????????? ? ???? ?? ?????? ???????? ?? ?????????
1992 ?????????????? ?? ????? ? ?????? (FDA, U. S. Food and Drug Administration) ???????? ?? ?? ?? ????? ???? ?????????? ???? ??? ? ?????????????? ?????
1994 ???????? ?? ?????????? ???????? (FlavrSavr Tomato) ??????? ???? ?? ????? ???? ?? ?????? ???????? ?? ???????
1995 ?????????? ?? ?????? ? ??????? ??????? ?? ?????????
2000 ? ??????? ?? ??????? ??? ?? ?????? ???????? ?? ?????????, ??????? ??? ??????, ????? ??????, ????, ??????? ????, ????????, ??????, ????????, ???????, ??????? ? ?????????
2001 ???????????? ????????? ? ??????????? ??????? ???????(Golden rice), ????????????? ?? ? ?????? ????????? ß-???????
5
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6
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7

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8
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tumefaciens AGL1/pDM805. ? - ???????
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mg dm-3 L-PPT. ? - ?????????????? ????? (?????) ?
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Basta. ????? ???????? ?? Sretenovic-Rajicic et
al. (2004), ?? ?????????? ??????.
9
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III
Bacillus thuringiensis
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I
II
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R
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(Ostrinia nubilalis) ?-???????? ??????
(Helicoverpa armigera) ?- ?????? ?????? (Danaus
plexippus).
10
www.agbios.com/dbase.php
11
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12
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14
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CaMV 35S ????????
15
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??????????????? ????????? HDEL/KDEL/RDEL ????? ?????? ?? ?-?????????
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17
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????????????, nicking ???????????? ???????????????
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pNpNpNpN-OH pNpN-OH
5-pNpNp?NpNpNpNp?NpN-OH3 ? pNpNp HO-NpNpNpNp
HO-NpN-OH
18
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??????? ???????? ?? ?????? ????? ??? ???????????? III
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????? ? ????????????? ???????? BAL 31
???????? ?????????? ????????? ??? BAL 31
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DNA footprinting DNAseI
??????? ????????????? ??????? DNAseI, nicking ????????????
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???????? poly(A) ???? ?? mRNApoly(dT) ??????? RNAse H
???????? ????????? ???????? RNAse A
???????? ???????????????? ?????? ??? ?? ?????? ? ?????? ??????? RNAse A, RNAse T1
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19
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20
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21
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B ???? ?? ??? (both) ?????? ?????, ??? ?????, ???? ?? ?? ?????? ? ???? ???????? ???? ?????? ????? ????????????. ?? ? ? ???? ??????????? BcgI (10/12)CGANNNNNNTGC(12/10)
C ?????????? ??? ??????????? ????? ?? ? ? ?? ????? ??????????-??????????? (combined). ???? ?????? ???????? ??? ?????? ??????? IIB, IIG ? ???? IIH. GsuI HaeIV BcgI CTGGAG(16/14) (7/13)GAYNNNNNRTC(14/9)Ą (10/12)CGANNNNNNTGC(12/10)
E ?????????? ?? ??? ?????? ????? ????? ?? ????, ? ????? ?? ??????????? ??????? EcoRII NaeI ?CCWGG GCC?GGC
F ??? ????? (??????)- ??? ?? ???? ???????????? SfiI SgrAI GGCCNNNN?NGGCC CR?CCGGYG
G ?????????? ??? ??????????? ?????. S-???????????????? ????? ?? ????????? ?? ? ? ???? ??????????? BsgI Eco57I GTGCAG(16/14) CTGAAG(16/14)
H ?????????? ??? ??????????? ?????. ????????? ???? ?????? ??? ??? ???? I (Hsd), ??? ?? ??????????? ???????? ??? ??? II BcgI AhdI (10/12)CGANNNNNNTGC(12/10) GACNNN?NNGTC
M ?????????? ??? ??????????? ?????. ????????? ?????????? ?????. DpnI Gm6A?TC
P ?????????? ????? ???????????? ? ?????? (?????????). ??????????, ???? ????????? ? ??????? ?????????, ????????????????? EcoRI PpuMI BslI NlaIII G?AATTC RG?GWCCY CCNNNNN?NNGG CATG?
S ??????????? ????? ???????????? ? ??????????? ???????? ???? ?? ????, ???? ?? ????? ????? ???????????? (shifted) ??? ??????? ? ? ?????? IIA. ????? ??? ??????- ????? ?? ???????????? ???????? ? ????? ??????????? FokI MmeI GGATG (9/13) TCCRAC(20/18)
T ?????????? ??? ??????????? ?????. ????????????. Bpu10I BslI CCTNAGC(-5/-2) CCNNNNN?NNGG
22
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?? ???? ????????? ????? 3500 ???? ??????. ???? ??
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????????? ???? ???? ?????????? ???? ?????????????
???????? ??? ?? ?? ?????????? ?? ???? II.
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BamHI (5 ???????) BglII (5 ???????) KpnI (3 ???????) SmaI (????? ???????)
5'---G GATCC---3 3'---CCTAG G---5' 5'---A GATCT---3 3'---TCTAG A---5' 5'---GGTAC C---3 3'---C CATGG---5' 5'---CCC GGG---3 3'---GGG CCC---5'
?????? ????? ???????????? ?? ????? ??? ?????? ??,
??? ?? ?????? ?????? ???????????
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?????????? ? ???? ???? ???????? HpaII (C?CGG) ?
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??? ???????? ??? ?? ???? ????????? AatII
(GACGT?C) ? ZraI (GAC?GTC)
23
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(Single Nucleotide Polymorphysms, SNPs)
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24
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?????? ???????? ? ??????? ?? ??? ?????? ??????? ?4 ??? ??????
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?????????? ??? ? ??? ? ?????????? ????????? ?4 ??? ?????? ?4 ??? ?????? 2
??????????? 3'-??????? ??? ?4 ??? ?????? 1
?????????? ????????????? ?????????? ??? ??? ??? ?4 ??? ?????? 1
???????? ????????? ??????? (Ligase Detection Reaction) ??????? ???????? ?????? (Ligase Chain Reaction) Taq ??? ?????? 9oN ??? ??????
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26
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27
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28
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  ??????????? ???????? ??????????? ?????????? ????
  ? ????? NTPa ???. dNTPa ??????? ?? ????????, ???
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  ??????????.
• ???????? ????????????? ?????????? ??????????????
  ??? ?? ?????? ??? ??????? ???????? ?????????????
• ?????????? ??????????? ?????????????? ???
  ???????????? 3'-???????
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  ??????????????? ????????? (?????????,
  ?????????????? ???????...), ???? ? ??????? ??????
  ?? in vitro ?????????????.
• ???-??????? ??? ??????????
• ?????????? ?????????????? ??????????
• ?????????????? ?? ???? ?????? ? 5?3 ??????, ??.
  ?????????? ?? ?????? ?? 3'-????
• ?? ?????????????? ?? ????????? ???????? 3'-??
  ????????
• ?? ?????????????? ?? ????????? ???????. ?? ?????
  ??? ?????????? ?? ???? ?? ??????? de novo ???????
  ???. ?? ????? ??? ?????????? (???? ??????????
  ???????????) ??? ??????? ?? ???? ?? ???????
  ???????? ?????????? ???, ??? ????
• ???????????? ??? ?? ??????????????
  ???????????????? - ?????????.
• ?????????? ??? ?? ?????? ??? ????? ?????????
  ?????? ????? (gaps) ???
• ?????????? ??? ????? ????? 5' ????
• ?????????? ??? ?? ????????????? ?????????
  (nicks)- ???? ? ??????? ????? ?????????? ??? ???
  ?? E. coli ??? ?????????? I ? ??? Klenow ????????
• ????????? ?? dNTPs
• Mg2 ???? ?? ????????? ?? ??? ??????????.

29
????? ??????? ?? ?????? ?? ??? ??????????
????????? ?? ??????? (fidelity) ?????? (??
????????? ??????????/s) ???????????? (??
????????? ?????????? ??? ???????????? ??
???????) ??????? - ?? ?????? ??? ?????????? ??
???, ? ?? ???????? ????????????? ?? ??? 3?5
????????????? ????????? (proofreading) 5?3
????????????? ????????? (nick translation) ??????
????? (strand displacement) ???????????????
?????? ?? ???? ????????? ?? ????? ?? ?????
???????? (?????????, ?????????, ??????????????)
5'?3' ??????????? ?????????
5?3 ????????????? ????????? ?? ??????? ??
?????? ???????? ??????? (Nick translation),
3?5 ?????????????? ????????? ?? ??????a ??
high-?delity PCR, ???????? 3'-??????? ???? ?????
? ??????? ?????? ?????, ? ????????? ?? ?? ???????
?????????????, ????????????? ??? ??????????
??????????
?????? ????? (strand displacement) ?? ??????????
?????????? ?????? ????????? 5?3 ???? ?? ??????
????? ????? ?? ??????. ??? ?? ??????? ??
??????????? ????????????? (Strand Displacement
Amplification, SDA)
30
?????????? 3?5 ???? 5?3 ???? ?????? ????? ?????. ??????? ?10-6 ?????- ??????- ???? ???????
E. coli ??? ??? I - 9 - Nick ??????????? ??????? 2. ????? ??????????? 3' ???????
E. coli ??? ??? I Klenow ????. - 18 - ???????????? ??????????? ??????? ??????????? 3' ??????? ??????? 2. ?????
E. coli ??? ??? I Klenow ????. 3?5 ?xo- - - 100 - ???????????? ??????? 2. ????? ??????????? ??? ?????????? ??????????
T4 ??? ???. - - 1 - ?????????? ??????? ??????????? ??????? ??????? 2. ????? ???????. ???????????
T7 ??? ???. - - 15 - ???????? ????? ????????? ??? ??????? 2. ????? ?????????? ???????
Sequenase - - - ????????????
f29 ???. - - ??????????? ?????????????
Bst ??? ???. - - /- /
Bst ??? ???. ?????? ???????? - - /- ???????????? ??? GC-??????? ??????? ? ????? ???????? ??????
Taq ??? ??? I - - 285 PCR ???????????????? PCR ?????????? ???????? ?????. ??????????? Nick ???????????
Pfu ??? ??? - 1.6 PCR ?????? ????????
VentR ???. - 57 PCR ?????? ???????? ?????????? ????????
Deep VentR - 20-45 PCR ?????? ???????? ?????????? ????????
PhusionTM 0.44 PCR ?????? ???????? PCR- ??????? ????????? ?????????
9Nm ??? ???. - ?????????? ???????? SNP ???????
TherminatorTM - - ?????????? ????????????? ????.

M-MuLV RT - - - ???????? ????????????? RT-PCR
AMV RT - ???????? ????????????? RT-PCR ???????????? ???
Poly(A) ???. ????????/??????????? Poly(A) ???? ?? ??? 3' ??????????? ???
Poly(U) ???. 3' ??????????? ???
f6 RdRP ??????? ?????????? ???
SP6, T7 ? T3 ??? ???. ?????????????
31
Klenow ????????
32
?????? ??????
?4 ????????????? ?????? ?????????? ????????
?-???????? ????? ???-? ?? 5'-???? ??? ??? ???, ??
?? ??????? ?? ????????????? 5'-??????? ??? ??
????????? ???????? ?????, ??? ?? ????????? ??
????????. ???? ?? ????????? ? ?? ????????????
??????????? ??????? ??????????? ???????? ??? ??
??? ???????? ??????? ?-32???? ???????
????????? ?? Zn2-???????????? ???? ??
???????????? ?? ?? 8-9, ? ?????????? ????????
5'-???????? ????? ?? ???, ???, rNTP-a ? dNTP-a.
??????? ?????????? ????????????? (site-specific
recombination systems) ?? ????????? ?? ?????? ?
???????????? ???? ???? ?? ?? ????????? ? ?????
???????? ? ????? ???????, ??? ??????????
??????????? ???????? ?????? ? ?????? ?????????
(excision). ??? ??????? ????? ?????? ??????? ?
????????????, ? ?? ??????? ?? ?????? ???????????
? ?????????? ???????? ???? ???? ???????????
?????????? ? ?? ???? ??????. ?? ??????? ???????
?? ??????? ??????? Cre/Lox, Flp/FRT, R/RS ?
Int/att.
33
?????????????? ? ????????? ??????????? ?????? -
2. ?????????

• ???????
• ????????
• ????????????
• ???????? ??????? ??????? ?????????? ? ????????
  ?????????
• ??????????????
• Agrobacterium tumefaciens ? ????????
  ?????????????? ??????
• ????????????? A. tumefaciens ??????? ???????
• ?????????????? ?????? Agrobacterium rhizogenes
• ???????? ??????????????
• ???????????????
• ??????????? ??????????????
• ?????????
• ?????? ????????????? ???????
• ????????? ????????? ???????????? ?? ???????????
  ? ?????????
• ????????? ?????????
• ???????? ????????? ???????? ?????? ?
  a-???????????????
• ???????? ???? ? ?????? ??????

34
???????

• ??????? ?? ????????? ?? ??? ???????? ???? ??
  ??????? ?? ????????? ?????????? ???????? ??????
  ?????????? ???????? (???????????? ? ??????
  ??????) ? ???????? ? ?? ???????????? ????????? ?
  cDNA ??????????. ??? ?????????????? ?
  ???????????? ??????? ?????? ?? ????? ???????
  ???????
• ????????? ????????? ???????????
• ????? ????????? ?????? (??? ???????) ?? ?????????
• ??????????? ???????????? ????? ?? ?????????
  ???????????? ??????
• ????? ????????? ???????? ????????????? ???.

?????? ????????? (Kb) ??????? ??. ??????
Ti ???????/ ??????? ?????? 5-10 (max 20) A. tumefaciens ??????
Ri ???????/??????? ?????? 5-10 (max 20) A. rhizogenes ??????
?????? ???????? 5-10 (max 20) E. coli ??????
? ??? 20 E. coli ??????
??????? 35-45 E. coli ??????
??????? 45 E. coli 1
?1 70-100 E. coli 1
PAC 130-150 E. coli 1
BAC 150-350 E. coli 1
YAC 250-500 (max 1 Mb) ?????? 1
35
????????

• ???????? ?? ?????????????????? ???????? ???
  ???????? 1-200 Kbp,
• ?????? ? ??????????? ?????????? ? ???????????,
  ??????????????? ?????
• ??????????? ? ??????????? ????????? ??
  ???????????? ?????????
• ?????? ??? ???? ????? ???????? - ?????????
• ??????? ?? ???????? ? ????? ??? ????? ????
  ????????? ?????? ?????? ? ???????? ????????? ??
  ??????????? ? ?????????????
• ????????? ?????? ???? ?????? ????? ????????? ??
  ?????? ????????? ??. ???????? ??????? ????????,
  ??? ? ????????? ??????? ?? ?????? ????????.
  ???????? ?? ????????? ???????? ???? ?? ???? ??
  ??????? ?? ????? ??????? ??????????? (Origin of
  Relication, ORI) ? ?????????? ?????????. ????????
  ???????? ?? ???????? ? ??? ??????? ????????? ???
  ???? ???? ????????? ?? ?? ???????? ? ???????
  ?????? ???? ??????.
• ????? ?????? ???? ???? ??????? ????????
• ???????????? ?? ???????????
• ?????????? ???????????
• ??????????? ?????????? ???????? ????????
• ?????????? ??????? ???????, ???????????? ? ??
• ?????????? ????????????? ? ?????????????? ??????

36
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