Les examens biologiques en H

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Les examens biologiquesen Hématologie

• Rémi Letestu
• Laboratoire dHématologie
• CHU Avicenne
• UFR SMBH
• DCEM1 (2006-07)

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Hématopoïèse
Cellules souches
Progéniteurs lymphoïdes
CFU-GEMM
MOELLE OSSEUSE
BFU-E
CFU-E
Tpo
réticulocytes
mégacaryocytes
SANG
plaquettes
éosinophiles
monocytes
T
B
érythrocytes
neutrophiles
basophiles
lymphocytes
macrophages
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Les différents examens
MOELLE OSSEUSE Myélogramme Biopsie médullaire
SANG NFS ou hémogramme Frottis sanguin
GANGLION (adénopathie) Ponction gg Biopsie gg
BIOPSIES Chirurgicales ou à laiguille
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Les différentes techniques
CYTOMETRIE EN FLUX ou IMMUNOPHENOTYPAGE
CYTOLOGIE Cytochimie
CYTOGENETIQUE
HISTOLOGIE ou ANATOMO-PATHOLOGIE
BIOLOGIE MOLECULAIRE
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Hémogramme ou NFS

• Définition analyse quantitative et qualitative
  des éléments figurés du sang
• Décompte des GR, GB, et plaquettes par unité de
  vol de sang (numération)
• Décompte des ? sous-types de GB (formule
  sanguine)
• Analyse morphologique de ces éléments

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• La Numération Formule Sanguine (NFS)
• Ponction de sang veineux
• Prélèvement sur anticoagulant EDTA
• Compteurs Automatiques
• importance des contrôles

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Valeurs Normales de l Hémogramme

• La Numération
• Globules Blancs 4-10x109/L 4-15x109/L
• Plaquettes 150-450 x109/L 20 x109/L
• Globules Rouges
• H 4.5-6.2 x1012/L F 4-5.4 x1012/L
• E 3.6-5 x1012/L NRS 5-6 x1012/L
• Hémoglobine (Hb)
• H 13-18 g/dL F 12-16 g/dL
• E 12-16 g/dL NRS 14-20 g/dL
• Hématocrite
• H 40-54 F 35-47
• E 36-44 NRS 44-62

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Valeurs Normales de l Hémogramme

• Les Réticulocytes
• Automates / Coloration sur lame (/1000 GR)
• Environ 1-/120 des GR
• Expression en valeur absolue
• 25000 à 100000 quand Hb Normale
• La Formule
• Polynucléaires Neutrophiles 1.7-7x109/L
• Polynucléaires Eosinophiles 0-0.5x109/L
• Polynucléaires Basophiles 0-0.05x109/L
• Lymphocytes 1.5-4x109/L
• Monocytes 0.1-1x109/L

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Valeurs Normales de l Hémogramme

• Les constantes de Wintrobe
• Volume Globulaire Moyen (VGM) 85-95 fl (83-97)
• Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb (CCMH)
  32-36
• Teneur Corpusculaire Moyenne en Hb (TCMH) 27-32
  pg/cellule

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Frottis sanguin

• Technique
• Étalement dune goutte de sang sur une lame
• Coloration May-Grünwald-Giemsa (MGG)
• Analyse au microscope
• Indications
• Diagnostic danomalies morphologiques
• Des GR
• Des GB
• Des plaquettes
• Recherche et identification de cellules anormales
• myélémie,
• blastes
• cellules lymphomateuses
• Vérification du nombre de plaquettes

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Quand prescrire un Hémogrammeen urgence

• Etat de choc
• Pâleur intense, asthénie,
• Angine ulcéro-nécrotique ou résistante aux
  antibiotiques
• Fièvre élevée après prise de médicament, surtout
  après chimiothérapie anti-mitotique
• Fièvre résistante aux antibiotiques
• Purpura pétéchial, syndrome hémorragique

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Valeurs de lhémogramme indiquant une
consultation spécialisée en urgence

• Hématocrite supérieur à 60
• Anémie inférieure à 7 g/dl ou mal tolérée
• Neutropénie inférieure à 200/mm3 (0.2 G/L)
• Hyperleucocytose faite de cellules immatures
  supérieure à 20 000/mm3
• Thrombopénie inférieure à 20 000/mm3 (20 G/L)
  même sans syndrome hémorragique
• Après élimination dune fausse thrombopénie à
  lEDTA

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Le Myélogramme

• Historique
• 1920-1927 Arinkin -1935 Mallarmé
• Ponction Sternale / Iliaque Post gt Antérieure
• Indications
• Nombreuses toute suspicion danomalie centrale
  de production des éléments du sang
• Anémies normo ou macrocytaires arégénératives
• et/ou Neutropénies
• et/ou Thrombopénie
• Pancytopénie
• Pic monoclonal
• Diagnostic
• Analyses spécialisées
• Contre-indications
• Très rares - Enfant - Contre indication
  sternale
• Troubles graves de la coagulation

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Le Myélogramme

• Précautions
• Indispensables
• Chez l enfant
• Formation au geste
• Règles strictes
• Déroulement du geste
• Anesthésie locale
• Ponction
• Réalisation des frottis
• point essentiel

Trocart de type Mallarmé
Trocarts de type Jamshidi
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• Le Myélogramme
• Quantité Qualité de la Moelle Osseuse
• Cellules à l origine des éléments circulants
• Exploration des lignées Myéloïde et Lymphoïde

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La lignée granuleuse neutrophile
MB Myéloblaste
PML Promyélocyte
MLN Myélocyte neutrophile
MMLN Métamyélocyte
PN Polynucléaire neutrophile
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PROER Proérythroblaste
La lignée érythroblastique
ERB Érythroblaste basophile
ERP Érythroblaste polychromatophile
ERA Érythroblaste acidophile
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L Adénogramme

• Organe lymphoïde
• Exploration des lignées Lymphoïdes
• Ponction aiguille
• Frottis

Facile, non douloureux, informatif
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Les Biopsies

• Chirurgicales
• Masse tumorale (lymphomes)
• Ganglion La biopsie ganglionnaire
• A laiguille
• Sous Scanner
• La Biopsie Ostéo-Médullaire (BOM)

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La biopsie ganglionnaire

• Prélèvement ganglion entier par technique
  chirurgicale
• Morphologie, coupes histologique
• Immunomarquages sur lame
• immunocytochimie
• Suspension de cellules

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La biopsie ostéomédullaire (BOM)

• Historique
• 1920-1927 Arinkin
• 1950 développement
• Ponction Iliaque Post
• Indications
• Nombreuses
• Diagnostic et Bilan d extension
• Analyses spécialisées
• Contre-indications
• Rares
• Troubles graves de la coagulation
• Thrombopénie sévère, thrombopathie
• Déroulement du geste

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La Cytométrie en Flux
Système Fluidique

• Mélange cellulaire hétérogène et complexe
• Injection de la suspension cellulaire
• Liquide de gaine sous pression
• Etirement de la veine liquide
• Alignement et passage des cellules une par une
  dans la chambre d analyse

Paramètres Optiques

• Dans la chambre danalyse impact avec un
  faisceau LASER
• Lumière monochromatique cohérente

• Eclairage de la cellules
• Taille relative Forward Scatter ou FSC
• Complexité cytoplasmique Side Scatter SSC
• Excitation des fluorochromes et émission de
  fluorescence

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Paramètres fluorescents
Pourquoi la cellule est-elle fluorescente ?

• Les cellules expriment des marqueurs
  antigéniques
• Protéines
• Sucres
• En surface ou en intracytoplasmique
• Marqueurs classés en CD (Cluster de
  Differenciation)
• Sélection danticorps reconnaissant
  spécifiquement ces marqueurs
• Couplage des anticorps à différents
  fluorochromes

• Signaux fluorescents recueillis
• Nombre et type de marqueurs exprimés Qualitatif
• Densité dexpression Quantitatif

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Conversion en données numériques

• Recueil des signaux optiques
• Miroirs, filtres, photomultiplicateur
• Transformation en signaux électroniques pour une
  analyse informatique avec un logiciel dédié

• Mise en forme des données
• Analyse des graphes, positionnement des seuils de
  positivité et des populations dintérêt,
  statistiques

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Applications dans un Laboratoire de Recherche

• Etudes de la fonction Immune
• Cellules Hématopoïétiques
• Etudes Multi-drug résistance (cancer)
• Etudes cinétiques (fonction cellulaire)
• Analyse des plaquettes
• Détection des Microorganismes (Bactéries,
  Parasites)
• Analyse des échantillons de lenvironnement
  (Giardia, Cryptospiridium)
• Détection Micro-Particules Virus

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Applications en Biologie Médicale

• Immunophénotypage Leucémie et Lymphomes
• Suivi de la maladie résiduelle des hémopathies
• Immunophénotypage VIH
• Comptes Absolus CD4
• Numération cellules progéniteurs (CD34)
• Analyse des glycoprotéines plaquettaires
• Cycle cellulaire et ploïdie de tumeurs
• Numération des Réticulocytes
• Cross-Match (transplantation dorgane)
• Détection des Leucocytes Résiduels

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Cytogénétique
CaryotypeCultureMitosesClassement des
chromosomes
FISH Hybridation in situ de sondes fluorescentes
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Biologie Moléculaire

• PCR Polymerase Chain Reaction
• Sur ADN
• Sur ADN complémentaire RT-PCR

• Séquençage

n Cycles 2n copies
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Biologie Moléculaire
14q32

• Recherche déquivalent moléculaire de
  translocation
• IgH-Bcl1 et t(1114)
• IgH-Bcl2 et t(1418)
• Recherche dexpression dérégulée dun gène
• Cycline D1 (t(1114))
• Recherche de transcrit de fusion
• BCR-Abelson et t(922)

g
a
e
d
m
VH
DH
JH
120kb
11q13
RT-PCR quantitative (RQ-PCR) pour le suivi des
patients
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Culture des progéniteurs hématopoïétiques
EEC
CFU-E
EEC endogenous erythroid colonies
Formation des colonies érythroïdes  spontanées 
in vitro
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Conclusion Orientation Diagnostique