Viaggio nel tumultuoso mondo dei genomi

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Viaggio nel tumultuoso mondo dei genomi

• Alice Fulgido Giuseppe Cazzato

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Indice

• Concetti base
• Mutazioni e riarrangiamenti
• Processi di riparazione del DNA
• Metodi di studio dei cariotipi
• Allineamenti genomici
• Analisi delle regioni di breakpoint

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Concetti base

• GENOMA
• Intero patrimonio genetico di una specie.
  Esso però non comprende solo linsieme di tutti i
  geni necessari alla vita di un organismo, ma
  anche tutto il DNA non genico
• CROMOSOMI
• molecole di DNA organizzate in unità
  strutturali e funzionali in cui è suddiviso il
  genoma
• GENE
• unità ereditaria fondamentale degli
  organismi viventi
• contiene le informazioni genetiche che
  codificano per funzioni specifiche allinterno
  della cellula

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Relazione DNA-gene-cromosoma
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Confronto tra sequenze genomiche

• METODI
• - Mapping, determinare la posizione dei geni
  su un cromosoma e la distanza che li separa-
  Sequencing , identificare lordine delle unità
  chimiche base del Dna (sequenze nucleotidiche)
• BENEFICI
• - diagnosi e cura di malattie oggi incurabili
• - migliori selezioni di prodotti di agricoltura
  e allevamento
• - miglioramento nelle tecniche di investigazione
  criminale

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Riproduzione del DNA

• Processo molecolare di REPLICAZIONE DEL DNA
  comprende
• - formazione di legami idrogeno fra le basi
  complementari (A, T, C, G)
• - formazione di un legame covalente
  fosfodiesterico
• Processo di RIPARTIZIONE DEI CROMOSOMI nelle
  cellule figlie

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Replicazione del DNA
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Indice

• Concetti base
• Mutazioni e riarrangiamenti
• Processi di riparazione del DNA
• Metodi di studio dei cariotipi
• Allineamenti genomici
• Analisi delle regioni di breakpoint

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Cosè una mutazione?

• Il risultato del cambiamento di una o più basi
  del DNA
• Cause
• - Cambiamenti accidentali(durante i processi di
  replicazione e ricombinazione)
• - Mutageni
• (fisici o chimici)

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Mutazioni

• GENICHE interessano un singolo gene(consistono
  in sottrazione, aggiunta o sostituzione di uno o
  più nucleotidi)
• CROMOSOMICHE estese della struttura dei
  cromosomi, dipendono da una rottura e da una
  ristrutturazione anomala degli stessi cromosomi.
  
• GENOMICHE consistono in alterazioni non della
  struttura ma del numero dei cromosomi.

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Conseguenze delle mutazioni

• perdita di funzione del gene
• Misappaiamenti (appaiamenti errati)se non
  rimossi rapidamente si propagheranno nelle
  duplicazioni successive
• Ma anche
• Differenze migliorative (che permettono
  levoluzione della specie)

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Riarrangiamenti

• Modifiche della disposizione dei geni sui
  cromosomi.
• Svolgono un ruolo molto importante
  nellevoluzione della specie
• Hanno origine da uno o più DSB
• Avvengono quando i meccanismi di riparazione
  falliscono o quando si presentano errori
• Tipi delezione, inserzione, inversione,
  traslocazione, etc
  

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Tipi di riarrangiamento
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Indice

• Concetti base
• Mutazioni e riarrangiamenti
• Processi di riparazione del DNA
• Metodi di studio dei cariotipi
• Allineamenti genomici
• Analisi delle regioni di breakpoint

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Double Strand Break (DSB)

• Più frequenti rotture del DNA
• Interessa entrambi i filamenti complementari di
  DNA
• Conseguenza dell'esposizione del DNA ad agenti
  genotossici o di normali processi cellulari
• Se non riparata prontamente dalla cellula può
  causare gravi problemi di instabilità genomica
• Strategie HR (SSA), NHEJ, NAHR

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Homologous Recombination (HR)

• Ricombinazione omologa
• Cromosoma omologo al danneggiato è usato come
  stampo per la riparazione (error free)
• Conservativo
• Single Strand Annealing (SSA) variante di HR.
• - Si attiva se il DSB si realizza tra
  sequenze ripetute
• - Eliminazione di estremità non omologhe e
  
• allineamento di sequenze omologhe

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Non-Homologous End Joining (NHEJ)

• Ricongiungimento delle estremità non omologhe
• Non considera linformazione iniziale del DNA
• Può portare a delezioni o mutazioni

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NHEJ vs HR
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Non-Allelic Homologous Recombination (NAHR)

• Responsabile di parecchi disordini genomici umani
• Comporta il cosiddetto riarrangiamento non
  equilibrato acquisizione o perdita di DNA

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Fasi della ricombinazione

• Rottura e successiva riunione di due cromatidi (M
  e F)
• Produzione di due cromatidi riarrangiati (C1 e
  C2)

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Ricombinazione CROSSING-OVER

• Meccanismo di ricombinazione del materiale
  geneticoproveniente dai duegenitori
• Risutato il figlio eredita una mescolanza
  casuale degli alleli dei due genitori per i
  diversi caratteri.

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Indice

• Concetti base
• Mutazioni e riarrangiamenti
• Processi di riparazione del DNA
• Metodi di studio dei cariotipi
• Allineamenti genomici
• Analisi delle regioni di breakpoint

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Cariotipo

• Costituzione del patrimonio cromosomico di una
  specie dal punto di vista morfologico
• Analisi del cariotipo rappresentazione ordinata
  del corredo cromosomico di un individuo

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Studio di cariotipi

• Confronto fra cariotipi
• Bandeggio cromosomico (1970)
• FISH (1990)
• CGH-array
• Mappa genetica

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Bandeggio cromosomico

• Tecnica di colorazione con sostanze fluorescenti
• Vantaggi
• ricostruzione della mappa di tutti i cromosomi
  (morfologia) e messa in evidenza di
  eventuali mutazioni
• confronto fra cariotipi di differenti specie
  basandosi su tali modelli
• rilevazione di molteplici patologie pre e
  post-natali
• Limitazione bassa sensibilità diagnostica

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Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

• Ibridazione processo molecolare che unisce due
  singoli filamenti complementari di molecole di
  DNA per formare molecole con doppio filamento di
  DNA
• Utilizza sonde a fluorescenza che si legano in
  modo estremamente selettivo ad alcune specifiche
  regioni del cromosoma
• Possibili usi
• mappare la sequenze di uno specifico cromosoma
• colorare i cromosomi per raffrontare due specie o
  varietà utilizzando il DNA di interi cromosomi
• scoprire se un paziente è stato infettato da un
  agente patogeno (studi clinici)

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Esempio applicazione FISH
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Comparative Genomic Hybridization (CGH)

• Strumento diagnostico per la rilevazione di
  sbilanciamenti cromosomici
• Principio della tecnica si basa su una
  competizione per il legame di 2 DNA
  genomici (marcati con fluorocromi diversi) a
  cromosomi in metafase (non marcati e provenienti
  da un soggetto sano).
• Risultato rapporto delle 2 ?uorescenze. In caso
  di numero di copie normali avrò 2 copie di DNA da
  testare e 2 copie del DNA di controllo genomico,
  per cui il rapporto tra i 2 ?uorocromi 2/2 è pari
  a 1.
• Limite la variabilità della morfologia dei
  cromosomi che ne limitano la risoluzione a circa
  3-7 Mb per le delezioni e 2 Mb per le
  ampli?cazioni

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Array-CGH

• Il principio coibridazione del DNA in esame e
  del DNA di controllo, marcati con ?uorocromi
  diversi, su un microarray di cloni genomici.
• Sostituzione cromosomi delle metafasi di
  riferimento con una matrice su cui sono spottati
  cloni YAC, BAC o PAC corrispondenti a loci
  speci?ci del cromosoma.
• Vantaggi
• -immediata correlazione tra leventuale
  alterazione e una precisa posizione nel genoma
• -standardizzazione della tecnica,
  ripetibilità e af?dabilità del risultato

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CGH vs Array-CGH
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Mappa Genetica

• Basata sui dati di ricombinazione genetica
• Processo che determina la posizione relativa dei
  geni sui cromosomi a partire da un loco preso
  come riferimento
• Realizzata per mezzo di due tecniche principali
• - Analisi di linkage (analisi degli alleli
  di diversi marcatori allinterno di una famiglia
  di individui)
• - Mappa di radiazione ibrida
  (lirradiazione di cellule umane con dosi elevate
  di raggi X e la successiva fusione delle cellule
  irradiate con cellule di Hamster, consente di
  ottenere linee cellulari nelle quali frammenti di
  cromosomi umani risultano integrati nel genoma di
  Hamster)

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Indice

• Concetti base
• Mutazioni e riarrangiamenti
• Processi di riparazione del DNA
• Metodi di studio dei cariotipi
• Allineamenti genomici
• Analisi delle regioni di breakpoint

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Allineamento genomico

• Scopo mettere a confronto sequenze di genomi
  della stessa specie o di specie differenti, con
  lintento di trovare la percentuale di DNA
  comune(conservato), rispetto alla percentuale di
  DNA che ha subito modificazioni(riarrangiamenti)
  nel corso dellevoluzione o a causa di errori
  allinterno dellorganismo.
• Tipi di algoritmi di allineamento locali e
  globali

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Esempio di allineamento genomico

• Date due sequenze nucleotidiche,determinare
  se sono suf?cientemente simili da farci ritenere
  che siano derivate da un progenitore comune
  attraverso processi di mutazione.

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Quale è lallineamento (statisticamente)
migliore ?

• Per confrontare quantitativamente gli
  allineamenti è necessario definire uno score

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Possibili allineamenti
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Algoritmi globali e locali

• Globali
• - gestiscono lallineamento di sequenze intere
• -svantaggio i segmenti delle sequenze devono
  essere ordinati e non presentare cambiamenti.
• Locali
• -si allineano sottosequenze delle sequenze di
  partenza
• (ad esempio lalgoritmo di Smith-Waterman)
• -privilegiati rispetto a quelli globali

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Risultato di una procedura di allineamento

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Metodo seed-extend

• Strategia di allineamento
• Si basa su
• - trovare la parte di segmenti
  conservati(definiti ancore)
• - allineare attorno alle ancore i segmenti
  riarrangiati

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Step

• ANCHORING Individuare le potenziali regioni di
  omologhi (ancore)
• Filtrarle (ossia eliminare i falsi positivi e
  fare una scelta fra le differenti copie di
  elementi duplicati)
• Allineare le regioni omologhe identificate
  (tenendo conto di eventuali gap)

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Indice

• Concetti base
• Mutazioni e riarrangiamenti
• Processi di riparazione del DNA
• Metodi di studio dei cariotipi
• Allineamenti genomici
• Analisi delle regioni di breakpoint

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Individuazione dei breakpoint (tramite metodi di
allineamento genomico)

• Lo scopo non è presentare un metodo specifico (ve
  ne sono molti, con scopi diversi) ma dare le idee
  base.
• Nella discussione utilizzeremo le idee presentate
  in
• GRIMM-SYNTENY
• CHAINNET
• Couronne Patcher (CP)
• MAUVE

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BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

• Strumenti per la ricerca rapida di sequenze di
  similarità in banche dati di DNA e proteine.
• Perchè?
• I programmi dinamici (Smith-Waterman) sono stati
  ideati per allineare due sequenze in modo esatto
  ma sono troppo lenti per fare ricerche in banche
  dati.
• Come?
• Sfruttando lindicizzazione delle sequenze nel DB

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BLAST - funzionamento

1. Crea un elenco di parole di lunghezza W a partire
   dalla sequenza query.(W3 per le proteine, W11
   per il DNA)

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BLAST - funzionamento

1. Per ogni parola crea un elenco di parole affini
   (W-mers) con score maggiore di una soglia T

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BLAST - funzionamento

1. Analizza tutte le sequenze del DB cercando un
   match con un W-mers

1. Cerca di estendere ciascun hit in entrambe le
   direzioni (senza gap) e mantiene gli HSP che
   superano una certa soglia S

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Anchoring 1/2
Individua la similarità locale tra due genomi

• GRIMM-SYNTENY
• esegue PatternHunter (gapped) e prende
  allineamenti unici e non sovrapposti
• CHAINNET
• esegue BLASTZ (gapped) e prende solo gli
  allineamenti non interrotti
• CP
• BLAT match quasi esatto ( veloce)
• MAUVE
• Solo allineamenti con match esatto e unico

Num. di basi trovate
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Anchoring (variante)

• Problema
• Due specie distanti ? DNA intergenico è mal
  conservato
• Sol.1 allineamento più lasco ? più falsi
  positivi
• Proposta utilizzare il DNA codificante (meglio
  conservato)ed effettuare lallineamento a
  livello di proteine(le ancore saranno i geni)
• Secondo gli studi di Bourque (confronto
  mammiferi/polli)i risultati con i due tipi di
  ancore sono consistenti.

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Filtering

• Idea basarsi sul contesto.
• Raggruppare le ancore
• GRIMM-SYNTENY
• Manhattan distance lt soglia
• Gruppi con almeno C coppie di basi
• CP
• Raggruppa senza tenere conto dellorientamento
  delle ancore
• Allineamento globale dei gruppi

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Filtering

• Collegare le ancore
• (considerando ordine e orientazione delle
  ancore)
• Chainnet
• Usa un albero a k-dimensioniUnancora potrebbe
  appartenere a più cateneNon butta via niente ma
  assegna un punteggio
• Mauve
• Ripete i passi precedenti con parametri sempre
  più stringenti
• Conserva le catene con più di X elementi

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Allineamento

• Si passa dalle ancore ad un unico allineamento
  estendendo i gruppi/catene trovati sinora
• Livelli di soglia e parametri minuziosi gt
  difficile fare un confronto tra gli algoritmi
• Ogni algoritmo è stato studiato per specifiche
  condizioni e specifiche tipologie di studi.

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Indice

• Concetti base
• Mutazioni e riarrangiamenti
• Processi di riparazione del DNA
• Metodi di studio dei cariotipi
• Allineamenti genomici
• Analisi delle regioni di breakpoint

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Analisi delle regioni di breakpoint

• Breakpoint
• porzione di genoma che è coinvolta in un
  riarrangiamento
• Regioni di breakpoint
• regione genomica tra due segmenti corretti

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Analisi delle regioni di breakpoint

• Analisi puntuale
• evoluzione di un breakpoint nel tempo Es
  studio malattia e sua evoluzione
• Analisi sistematica
• (tutti) i breakpoint nel complesso
• Più utile a livello statistico
• Molti progetti nellultima decade per
  cercarecaratteristiche comuni

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Obiettivo

• Scoprire i meccanismi molecolari che regolano i
  riarrangiamenti.
• modello di apparizione dei breakpoint ??
• Random Nadau Taylor -1980
• Hotspot Pevzner, Kent,
• (accettato per i breakpoint somatici)

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Studi sistematici

• Fenomeno perdita di similarità tra grandi
  blocchi di sintenia
• Causa ?
• Errori di allineamento Trinh, Sankov,
• Micro-riarrangiamenti Kent, -gt modello
  non-random(molti rearrangement rendono quella
  regione più propensa ad ulteriori
  rearrangement)

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Dupliconi

• Duplicazioni Segmentali (Low Copy Repeats)
• - elementi molto simili (gt95)- relativamente
  piccoli (1-15 kb)
• Spesso sono duplicati nella stessa regione
  cromosomica e sono quindi soggetti a
  ricombinazioni omologhe tra due copie in
  differenti loci ? NAHR

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• Sperimentalmente Duplicazione segmentale prima
  di un rearrangement
• Associazione tra i due cambiamenti
  (causa/effetto? ) Armengol
• Dupliconi e Rearrangement sono indipendenti
• Trovati solo di recente Bailey
• Caratteristici dei primati
• Si trovano entrambi nelle regioni di rottura

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Fragile sites

• Aree del cromosoma con tendenza a rompersi in
  specifiche condizioni di coltura cellulare
• La loro presenza indica una zona propensa a
  possibili riarrangiamenti e a rotture di tipo
  evoluzionistico(80 secondo gli studi di Ruiz
  Herrera)
• Non esiste un modello e tale correlazione (e sua
  tipologia) resta in discussione.

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Analisi puntuale

• Lesplorazione più in dettaglio del singolo
  breakpointporta a modelli per spiegare il
  rearrangement.
• Come al solito, molti studi e molti risultati
  diversi..
• Per quanto riguarda i dupliconi i risultati sono
  analoghi rispetto agli studi sistematici anche se
  in molti casi non si è ancora compreso il
  meccanismo esatto.

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Conclusioni

• Molti aspetti riguardanti i processi di rottura
  dei cromosomi sono ancora irrisolti.
• Trend combinare la potenza dellapproccio
  puntuale con le ipotesi generate da analisi
  sistematiche.
• Modello di distribuzione dei breakpoint sembra
  essere quello non-random

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References (principali)

• A small trip in the untranquil world of genomes.
  A survey on the detection and analysis of genome
  rearrangement breakpoints.
• Claire Lemaitre, Marie-France Sagot
• Genetica in una prospettiva genomica
• Hartl Daniel L. Jones Elisabeth W.
• Introduzione alla bioinformatica
• G.Valle, M.H.Citterich, M.Attimonelli,
  G.Pesole