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Terapia g

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Title: Slide sem t tulo Author: Hemocentro Last modified by: Usu rio Created Date: 10/26/1999 7:12:36 PM Document presentation format: Slides de 35 mm – PowerPoint PPT presentation

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Date added: 6 November 2019
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Transcript and Presenter's Notes

Title: Terapia g


1
Terapia gênica - Princípios gerais
  • Modificação genética das células para produzir
    efeito terapêutico
  • Ex vivo modificação genética feita em células
    em cultura que são administradas ao paciente
  • In vivo modificação feita diretamente no paciente

2
Terapia gênica - Princípios gerais
  • Necessidade de
  • se conhecer o gene terapêutico (clonagem do
    gene)
  • método para liberar o gene na célula alvo
  • Métodos mais promissores transferência gênica
    através de adenovirus associado e lentivirius

3
Células alvo para introdução de genes
  • Células humanas hematopoéticas,
    fibroblastos, hepatócitos, mioblastos, etc
  • Células xenogênicas murinas, porcinas,
    bovinas, outros primatas, etc
  • Desvantagens transmissão de retrovírus e
    xenoosis (algumas desconhecidas)

4
Métodos para introdução do DNA alvo
  • Virais
  • Retrovírus
  • Lentivírus
  • Adenovírus
  • Adenovírus associado
  • Herpes simples

5
Transferência Gênica
6
Lentivirus (HIV-1)
  • também codificam
  • tat e rev ? genes regulatórios da expressão
  • genes acessórios
  • Vantagens
  • promovem transporte ativo do complexo através do
    nucleoporo
  • infectam células que não estão em duplicação

7
Adenovirus
  • derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria
    dos adultos já foi exposta
  • eficientes para transferência gênica
  • não se integram no genoma (episomal)

8
Transferência Gênica
9
Adenovirus associado (AAV)
  • Parvovírus humanos que requerem um adenovirus
    para mediar infecção
  • Eficientes para transferência gênica
  • Não há doença conhecida associada com infecção
    pelo AAV
  • Podem integrar o genoma aleatoriamente ou
  • Podem ter localização episomal

10
Métodos para introdução do DNA alvo
  • Não-Virais
  • LIpofecção
  • Eletroporação
  • Precipitação com Fosfato de cálcio
  • Bombardeio de partículas

11
Transferência Gênica
12
(No Transcript)
13
(No Transcript)
14
Transferência Gênica
  • Injeção direta de DNA em células alvo
  • Ex Hemofilia B - injeção IM do gene do fator IX
  • Anemia - injeção IM do gene da
    eritropoetina
  • Neoplasias - injeção no tumor ? Gene
    p53
  • ? Gene suicida
  • ? Anti-sense
  • Infusão ou implante de células geneticamente
    modificadas

15
Regulatory Review Required for Gene Transfer
Trials
  • U.S.
  • Comitê de Ética Local
  • Comitê Local de Biosegurança
  • FDA
  • Recombinant DNA Advisory Committee, NIH
  • Brazil
  • Comitê de Ética Local
  • CONEP
  • Comitê Nacional de Biosegurança

16
Terapia gênica para hemofilia
  • Vantagens
  • níveis gt 2 efeito terapêutico
  • não é necessária regulação gênica refinada
  • não é necessária expressão tecido específica
  • rFVIII ou rFIX comerciais já existem
  • avaliação da eficácia é fácil níveis plamáticos

17
Ensaios Clínicos
  • Ex vivo transfecção de fibroblastos autólogos
    com plasmideo contendo F.VIII

18
(No Transcript)
19
Transplante de fibroblastos autólogo
  • Implantar células no omentum
  • Ex vivo ? pouco risco de transmissão para células
    germinativas
  • Expansão clonal de uma célula ? risco mínimo de
    mutagenesis
  • Procedimento trabalhoso

20
Ensaios Clínicos
  • In vivo
  • Infusão EV de vetor retroviral expressando F.VIII
  • Infusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIII
  • injeção IM de AAV/hF.IX
  • infusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IX

21
Hemofilia
  • Administração do vetor bem tolerada
  • Não houve formação de anticorpos
  • Detecção transitória do vetor em semem após
    infusão EV de retrovirus ou adenovirus em artéria
    hepática
  • Risco de transmissão para células germinativas
    parece baixa

22
Hemofilia
  • Outros tecidos além do fígado podem secretar
    fatores de coagulação biologicamente ativo
  • F.VIII administrado por métodos virais e não
    virais resultou em aumento transitório deos
    níveis de fator VIII (até 2) em poucos pacientes
  • Transferência de FIX mediada por AAV em músculo
    esquelético resultou em expressão duradoura de
    F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até 4)
  • Transferência de FIX mediada por AAV em fígado
    resutou em aumento de até 11 nos níveis de
    F.IX.

23
Ensaios Clínicos
  • 41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia
    gênica
  • Desafios
  • sustentar efeito
  • inibir resposta imune
  • aumentar expressão do transgene

24
Gene da Eritropoetina para tratamento de anemia
  • Vetor não viral
  • injeção IM em camundongos
  • estímulo elétrico

25
Hematócrito antes e após terapia gênica com gene
da EPO
26
O Sistema Tet-Off para controle da expressão
gênica
transativador
PCMV
tetR
AD
Doxociclina ou tetraciclina
Presença de transcrição
TRE
pCMV
Gene alvo
Ausência de transcrição
Gene alvo
TRE
pCMV
27
Controle da expressão gênica pela administração
de Doxociclina
Doxociclina
28
Células Progenitoras Hematopoéticas
29
Correção de hemoglobinopatia
  • anemia falciforme e talassemia (camundongos)
  • Vetor lentivirus
  • Gene beta-globina
  • Transferência do gene para células CD 34
  • Mieloablação e infusão das células modificadas

30
Correção de talassemia
31
Correção de doença falciforme



32
X-LINKED SCID FIRST EXAMPLE OF THERAPEUTIC GENE
TRANSFER
  • Lethal disease
  • Caused by gc cytokine
  • receptor deficiency
  • Curable by bone marrow
  • transplantation

Cavazzana-Calvo et al. Gene therapy of human
severe imunodeficiency disease. Science
288669, 2000
33

Terapia gênica para tratamento de
imunodeficiência grave
  • 2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação
    da cadeia gama do receptor comum para citocina
  • colhidas células precursoras hematopoéticas (CD
    34)
  • introdução do gene alvo retrovírus
  • reinfusão das células modificadas na corrente
    circulatória
  • Resultado
  • expressão do receptor nas células do sangue
    periférico e nos linfócitos
  • os linfócitos passaram a funcionar
  • redução das infecções

34
Terapia gênica para tratamento de deficiência de
adenosina deaminase (ADA)
  • Também causa imunodeficiência grave
  • 3 crianças com diagnóstico pré-natal
  • colhido sangue de cordão umbilical e separadas
    células precursoras (CD34)
  • introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)
    retrovírus
  • transplante autólogo
  • Resultado melhora das infecções

?
LTR
LTR
c DNA Adenosina deaminase
35
Detecção de vetor ADA por PCR semiquantitativo
Kohn et al, 1995, Nature Medicine
36
Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer
to tumors of patients with lung cancer
J.A. Roth, et al
Pretreatment (a and c) and 30 day posttreatment
(b and d) bronchoscopic images
Nature Medicine, Volume 2, Number 9, September
1996
37
Terapia Anti-sense
DNA alvo
DNA anti-sense
Transcrição
RNAm sense
RNAm anti-sense
Bloqueio da Tradução para proteína
38
Terapia Anti-sense
  • Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb
    et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996)
  • Metodologia 13 pacientes com linfoma que
    expressavam bcl-2, em recaída após vários
    esquemas de quimioterapia
  • 6 injeções parenterais do antisense
  • Resultados 1 paciente com resposta completa, 4
    pacientes com resposta parcial
  • Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense)

39
Produção de vacinas de tumor autólogo
Ressecção e cultivo de células tumorais
gene
Imunoestimulação das células modificadas
Injetar células sc
Testar expressão gênica
40
Gene Suicida
  • Ex HSV - TK

Herpes simples
Timidina Quinase
Ganciclovir
Fosforilação do Ganciclovir
Morte celular
41
Células xenogênicas para terapia gênica
  • Exemplo Linhagem murina produtora de vetor
    contendo o gene suicida timidina quinase
    regiões do vírus herpes simples para tratamento
    de Tumor cerebral
  • Objetivo induzir a transformação de uma
    pró-droga em droga. O herpes simples tem
    afinidade pelo sistema nervoso. A timidina
    quinase fosforila o ganciclovir . O ganciclovir
    fosforilado destrói a celula

42
Transferência de células produtoras de HSV-tk em
Tumor Cerebral
43
Ram et al, 1997 - Nature Medicine 31354
44
Ram et al, 1997 - Nature Medicine 31354
45
Segurança em Terapia Gênica
  • Vetor adenoviral expressando gene Ornitina
    Carboxilase (OTC)
  • Infusão em artéria hepática em adultos com doença
    leve ou heterozigotos
  • Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu
    altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg)
  • Desenvolveu febre, falência de múltiplos órgãos

46

Terapia gênica para tratamento de
imunodeficiência grave
  • Em 2002
  • 11 pacientes em tratamento com boa resposta
    melhora da imunodeficiência
  • 4 pacientes desenvolveram leucemia mielóide aguda
    (2002 , 2003, 2004)
  • Interrupção do protocolo
  • Pacientes com imunodeficiência teriam menos
    chance de rejeitar células neoplásicas??

47
Toxicidade potencial da terapia gênica
  • Relacionada ao vetor
  • resposta imune
  • integração
  • Relacionada ao Transgene
  • response imune
  • superexpression
  • Transmissão para células germinativas

48
Segurança em terapia gênica
  • Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar
    em genes ativos (exons)
  • Schroder et al (Cell, 2002)
  • Nakai et al (Nature Genetics, 2003)

49
Conclusão
  • Terapia gênica é uma realidade

50
Agradecimentos
  • Margareth Castro Ozello
  • Valder R.Arruda
  • Marcelo Agostinho Salomão
  • Denise Silvia Souza
  • Dilmara Lopes Vicentim
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