Metody NMR stosowane w badaniach

1
Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Cze
sc 4 Badania strukturalne oligosacharydów
2

• Zastosowanie spektroskopii NMR
• w badaniach oligosacharydów.
• Podstawowe definicje
• Budowa monosacharydów
• Struktura pierscieniowa i mutarotacja
• Wiazanie glikozydowe
• Glukoza i cyklodekstryny
• Laktoza
• Sacharoza
• Fukozylolaktozy
• Pentasacharyd mleka ludzkiego
• Faktor IX surowicy krwi ludzkiej

3
Definicje Sacharydy - zwiazki zbudowanie z
wegla, tlenu i wodoru. Ich inna nazwa -
weglowodany - nawiazuje do wzoru
sumarycznego Cm(H2O)n, który jednak nie zawsze
jest prawdziwy. Zawieraja liczne grupy
hydroksylowe (-OH) oraz moga zawierac szereg
innych grup funkcyjnych. Forma lancuchowa zawsze
posiada grupe karbonylowa (-CO-) lub aldehydowa
(-CHO) ketozy i aldozy.
Monosacharydy - pojedyncza jednostka
cukrowa. Oligosacharydy - niewielka liczba
(zwykle 2 - 10) reszt monosacharydowych
polaczonych wiazaniami glikozydowymi. Polisacharyd
y - makroczasteczki, w których bardzo duza liczba
reszt monosacharydowych jest polaczona wiazaniami
glikozydowymi.
Oligo- i polisacharydy moga byc liniowe,
rozgalezione lub cykliczne.
4
Dlaczego oligosacharydy sa wazne dla biologa
? Oligosacharydy organizmach wystepuja
samodzielnie oraz w polaczeniu z bialkami
(glikoproteiny) i tluszczami (glikolipidy). Gliko
proteiny - najliczniejsze bialka
zlozone wystepuja w osoczu krwi, erytrocytach,
blonach komórkowych, tkankach lacznych,
wydzielinach sluzowych, hormonach. Glikolipidy
wystepuja w blonach komórkowych
5
Monosacharydy - budowa triozy - 3 atomy
wegla, tetrozy - 4 atomy wegla, pentozy - 5
atomów wegla, heksozy - 6 atomów
wegla. Wiekszosc biologicznie waznych
monosacharydów ma 5 lub 6 atomów wegla.
6
Postac lancuchowa monosacharydów
Postac lancuchowa monosacharydów
Postac lancuchowa monosacharydów
Przyklad - dwie aldotetrozy erytroza i
treoza. Dwa asymetryczne () atomy
wegla powoduja pojawienie sie czterech stereoizome
rów. Dla pentoz istnieje 23 8 stereoizomerów.
Dla heksoz istnieje 24 16 stereoizomerów.
Przyklad - dwie aldotetrozy erytroza i
treoza. Dwa asymetryczne () atomy
wegla powoduja pojawienie sie czterech stereoizome
rów. Dla pentoz istnieje 23 8 stereoizomerów.
Dla heksoz istnieje 24 16 stereoizomerów.
1
2
3
4
enancjomery D erytrozy L
enancjomery D treozy L
7
Równowaga jest silnie przesunieta w strone formy
cyklicznej.
Pojawiaja sie dwa kolejne diasteroizomery.
a-D-erytrofuranoza
D-erytroza
b-D-erytrofuranoza
a-D-treofuranoza
D-treoza
b-D-treofuranoza
8
Postac cykliczna monosacharydów
Przy cyklizacji powstaje kolejny asymetryczny
atom wegla C1 zwany anomerycznym. Konfiguracja
wegla anomerycznego jest oznaczana a lub b. Cukry
tworzace pierscienie piecioczlonowe -
furanozy, Cukry tworzace pierscienie
szescioczlonowe - piranozy. Znaczenie biologiczne
maja D-monosacharydy. Nieliczne wyjatki dotycza
form L jedynie kilku monosacharydów (L-Fuc,
L-Glu, L-Gal,)
a-D
a-L
piranozy
6
b-L
b-D
1
4
9
W roztworze zawsze istnieje równowaga
pomiedzy stereoizomerami a i b Mutarotacja, to
przejscie a ? b przez forme lancuchowa.
Np. dla glukozy
a 36
b 64
10
Definicja katów torsyjnych ? i ? okreslajacych
konformacje wiazania glikozydowego na przykladzie
disacharydu b-laktozy.
Galb(1?4)Glcb
b-D-Galp(1?4)b-D-Glcp
? H1C1O1C4 ? C1O1C4H4
NOE H1H4 3J(H1,C4) 3J(C1,H4)
Jeden ze sposobów okreslania konformacji wiazania
glikozydowego.
11
Polisacharydy Celuloza ?4)Glc(b1?4)Glc(b1?
lancuch nierozgaleziony Glikogen
?4)Glc(a1?4)Glc(a1? oraz Glc(a1?6)Glca lancuch
rozgaleziony Chityna ?4)GlcNAc(b1?4)GlcNAc(b1?
lancuch nierozgaleziony Amyloza
?4)Glc(a1?4)Glc(a1? lancuch nierozgaleziony Amy
lopektyna jak glikogen Skrobia 25 amylozy i
75 amylopektyny.
12
Oligosacharydy zagadnienia rozwiazywalne przy
pomocy NMR
CO
Liczba i typ skladników oligosacharydów Polaczenia
cukrów w oligosacharydach Konfiguracja
anomerycznych atomów wegla Konformacja wiazan
glikozydowych
JAK
Przypisania sygnalów w widmach NMR Informacje
strukturalne z przesuniec chemicznych, stalych
sprzezenia spinowego i NOE
13
Przesuniecia chemiczne 13C wegli
anomerycznych Glca(1?4)Glca,b (a-92.8, b-96.8)
maltoza 100.7 Glcb(1?4)Glca,b (a-92.9, b-96.8)
celobioza 103.6
Sprzezenia spinowe 3J(H1,H2) w piranozach identyfi
kacja anomeru a-anomer (Glc, Gal, Fuc) J2 4
Hz, (Man) J1.6 Hz b-anomer (Glc, Gal, Fuc) J7
9 Hz, (Man) J0.8 Hz
14
Celobioza i maltoza (disacharydy) 13C NMR
maltoza Glca(1?4)Glca,b
celobioza Glcb(1?4)Glca,b
celobioza
maltoza
15
Przesuniecia chemiczne 1H - efekt
podstawienia a-Glc, 4)-aGlc6-(1 ,
4)-aGlc10-(1
3J(H1,H2)3,6 Hz
Typowe wartosci 3J(H1,H2) dla anomerów a
tych monosacharydów, w których H2 jest aksjalny.
3J(H1,H2)3,4 Hz
16
Laktoza w DMSO widoczne sa protony OH.
b-D-Galp(1?4)a,b-D-Glcp II
I
3.0
4.0
5.0
6.0
I1a
I1b
II1b
Glca 3J(H1,H2) 4,1 Hz Glcb 3J(H1,H2)
7,3 Hz Galb 3J(H1,H2) 7,5 Hz prosta metoda
odrózniania anomerów.
Katy dwuscienne dla HaxCCHax ?180? dla
HaxCCHeq ?60? zaleznosc Karplusa.
17
Laktoza w DMSO
3.0
3.5
II4a,b
I5a
70
II2a,b
I3a
I2a
b-D-Galp(1?4)a,b-D-Glcp II
I
II3a,b
I5b
I2b
75
I3b
II5a,b
Korelacja 1H/13C bez H1 i H6.
80
I4a,b
3.0
3.4
3.2
3.6
18
Disacharyd sacharoza aGlcp(1?2)bFruf
6
1
6
2
10,0 9,3
1
3,7 10,0
3,6 Hz
9,2 9,2
G6
F1
F6
G4
Brak sygnalu korelacyjnego dla F2, poniewaz
C2(Fru) jest czwartorzedowy.
F4
G2
G5 G3
F3
F5
G1
Odczynnik Cukrownia Dobrzelin, kampania
2006. Widma NMR Katarzyna Ruszczynska-Bartnik.
19
Fukozylolaktoza Galb(1?4)Fuca(1?3)Glca,b 1H
NMR w DMSO selektywne 1D TOCSY
Glcb
cale widmo
20
Fukozylolaktoza Galb(1?4)Fuca(1?3)Glca,b 1H
NMR w DMSO selektywne 1D TOCSY
Czesciowe widma fukoz pobudzenie IV H1
Glca
Glcb
21
Difukozylolaktoza Fuca(1?2)Galb(1?4)Fuca(1?3)Gl
ca,b 13C NMR w DMSO
22
Pentasacharyd wyizolowany z mleka
ludzkiego Galb(1?4)Fuca(1?3)GlcNAcb(1?3)
Galb(1?4)Glc-ol IV V
III II I
Widmo ROESY
J. Dabrowski, A. Ejchart, R. Brunz, H. Egge, FEBS
Lett., 1989, 246, 229.
23
Gliko-nonapeptyd, Faktor IX surowicy krwi
ludzkiej.
Przypisania - TOCSY Sekwencja - ROESY
R.J. Harris, H. van Halbeek, J. Glushka, L.J.
Basa, V.T. Ling, K.J. Smith, M.W.
Spellman, Biochemistry, 1993, 32, 6539.
Neu5Aca(2?6)Galb(1?4)GlcNAcb(1?3)Fuca(1?O)Ser61