PCR (polymerase chain reaction)

1
PCR (polymerase chain reaction)

• Chuong II

2
(No Transcript)
3
Gi?i thi?u
Kary Mullis 1985Nobel 1993
4
Gi?i thi?u

• PCR ph?n ?ng chu?i trùng h?p
• Là k? thu?t t?ng h?p nhân t?o các do?n DNA v?i
  t?c d? nhanh, có d? chính xác cao, không c?n s?
  hi?n di?n c?a t? bào
• Phaûn öùng PCR cho pheùp khuyeách ñaïi moät ñoaïn
  DNA naèm giöõa 2 moài chuyeân bieät, nhôø men DNA
  polymerase

5
Nguyên t?c

• D?a trên s? ho?t d?ng c?a emzyme
• S? hi?n di?n c?a m?i chuyên bi?t
• Kh? nang n?i dài m?i c?a taq polymerase
• Các nu t? do trong môi tru?ng

6
Máy PCR
7
Th?c nghi?m

• Ph?n ?ng PCR là m?t chu?i nhi?u chu k? m?i chu k?
  g?m 3 bu?c
• Bu?c 1 Bi?n tính (denaturation)
• 94-98oC
• 2-5 phút
• Bu?c 2 G?n m?i (anneealing)
• 30-65oC
• 20s-2
• Bu?c 3 kéo dài (extending)
• 68-72oC
• 20s-5

8
Th?c nghi?m
http//users.ugent.be/avierstr/pdf/PCR.pdf
9
III. TH?C NGHI?M
http//users.ugent.be/avierstr/principles/pcrani.
html
10
III. TH?C NGHI?M
http//faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/PCRmov
.html
11
Moài (primers)
oligonucleotide ñôn maïch (18-24 b) boå sung
vôùi 2 vuøng treân trình töï DNA Moài xuoâi
(sense primer hoaëc Forward) baét caëp vôùi maïch
khuoân cuûa DNA vaø seõ keùo daøi theo chieàu
phieân maõ Moài ngöôïc (anti sense primer hoaëc
Reverse) baét caëp vôùi maïch maõ cuûa DNA vaø
seõ keùo daøi ngöôïc theo chieàu phieân maõ
12
THI?T K? M?I

• Nguyên t?c
• Trình t? c?a m?i du?c thi?t k? sao cho không có
  s? b?t c?p gi?a m?i xuôi và m?i ngu?c, k? c? c?u
  trúc k?p tóc
• Nhi?t d? g?n m?i c?a m?i xuôi và m?i ngu?c không
  du?c chênh l?ch quá xa (Không nên quá nhi?u G
  ho?c C n?i ti?p nhau thu?ng t? l? G, C n?m trong
  kho?ng 30lt GClt70))
• Không nên nhi?u b?t c?p sai v?i DNA khuôn
• Các m?i du?c ch?n ph?i d?c trung cho trình t? DNA
  c?n khuy?ch d?i không trùng v?i các trình t? l?p
  l?i trên DNA
• Trình t? n?m gi?a m?i xuôi và m?i ngu?c không quá
  l?n (lt3000 t?t nh?t là du?i 1000)

13
THI?T K? M?I

• Cách thi?t k? m?i
• M?i xuôi cùng trình t? v?i m?ch mã
• M?i ngu?c là trình t? ngu?c và b? sung v?i m?ch
  mã
• Cách tính Tm (nhi?t d? g?n m?i)
• Tm 4(GC) 2(AT)

14
Polymerase chòu nhieät
Taq-polymerase töø Thermus aquaticusNhieät ñoä
toái öu 72?CCoù hoaït tính 5'-gt3' polymerase
Coù hoaït tính terminal transferase theâm 1
Adenosine ôû ñaàu 3 cuûa maïch DNA môùi. Khoâng
coù khaû naêng söûa sai (2x10-5 , 0.25 sai sau
30 chu kyø)Sao cheùp 2000b/min. Khoâng sao
cheùp ñöôïc treân 3kb
Pfu-polymerase töø Pyrococcus furiosusNhieät
ñoä toái öu 72?CCoù hoaït tính 5'-gt3'
polymerase vaø 3-gt 5 exonucleaseTyû leä cheùp
sai thaáp (1.5x10-6)Sao cheùp 500b/min
15
Buffers

• Có nhi?u lo?i buffer s? d?ng riêng cho t?ng lo?i
  enzyme.
• M?t s? buffer ch?a ch?t ho?t d?ng b? m?t có th?
  ?nh hu?ng d?n các ph?n ?ng
• Nhi?u lo?i buffer dã có s?n ion Mg2

16
N?ng d? Mg2 và dNTP

• N?ng d? ion Mg2 cao xu?t hi?n thêm các s?n ph?m
  không d?c hi?u.
• N?ng d? ion Mg2 th?p lu?ng s?n ph?m PCR th?p.
• N?ng d? ion Mg2 ph? thu?c vào lo?i DNA
  polymerase, DNA m?u và thành ph?n buffer
• gradien n?ng d? t? 0.5 d?n 2 mM v?i các kho?ng
  cách m?i bu?c là 0.2 mM.
• dNTPs là lo?i hóa ch?t kém b?n
• Lu?ng dNTP t?i uu là 200 µM of m?i lo?i dNTP.
  Vi?c tang dNTP không làm tang dáng k? lu?ng s?n
  ph?m PCR so v?i vi?c hi?u ch?nh các y?u t? khác

17
Ch?t khác

• Ð?i v?i các DNA template l?n, giàu GC thì có th?
  s? d?ng các ch?t bi?n tính nhu DMSO, formamide,
  glycerol, and betaine trong thành ph?n PCR.
• Tang lu?ng DMSO trong PCR s? c?n gi?m nhi?t b?t
  m?i xu?ng.
• D?u khoáng

18
CÁC CH? TIÊU ?NH HU?NG Ð?N PH?N ?NG PCR

• 1. DNA m?u (100ng-1?g)
• 2. Enzyme
• 3. M?i và nhi?t d? g?n m?i (nhi?t d? lai)
• 4. dNTP 20-200?M/ m?i l?ai nu
• 5. N?ng d? Mg
• 6. S? lu?ng chu k? ph?n ?ng
• 7. Thi?t b? và d?ng c? cho ph?n ?ng

19
M?t s? v?n d? thu?ng g?p

• Không có s?n ph?m ho?c lu?ng s?n ph?m quá th?p
• Ki?m tra l?i DNA m?u, thao tác
• Tang th?i gian kéo dài, s? chu k?, nhi?t d? bi?n
  tính
• H? nhiêt d? g?n m?i
• Primer, buffer

20
M?t s? v?n d? thu?ng g?p

• V?t smear kích thu?c l?n hon s?n ph?m mong mu?n
• Gi?m DNA, th?i gian kéo dài, s? chu k?
• Tang nhi?t d? g?n m?i
• Thay d?i n?ng d? Mg2
• Tang th?i gian kéo dài n?u sp mear có kt nh?

21
M?t s? v?n d? thu?ng g?p

• Bang s?n ph?m ph? rõ nét v?i kích thu?c th?p hon
  s?n ph?m mong mu?n
• Tang nhi?t d? b?t m?i 2C và/ho?c tang th?i gian
  b?t m?i
• Tang th?i gian kéo dài thêm 30s.
• Gi?m n?ng d? DNA polymerase.
• T?i uu hóa n?ng d? Mg2.
• Tinh s?ch DNA template
• Gi?m n?ng d? primer.
• Thi?t k? c?p primer m?i.

22
(No Transcript)
23
Real-time PCR
24

• Moät maùy luaân nhieät
• Moät heä thoáng phaùt vaø ñoïc tín hieäu huyønh
  quang
• Chöông trình vi tính ñeå theo doõi vaø phaân
  tích keát quaû

25
Quaù trình nhaân baûn sao ADN trong moät phaûn
öùng PCR
26
A-6 10-6 ng A-5 10-5ng A-4 10-4ng A-3
10-3ng A-2 10-2ng A-1 10-1ng A1 1ng
PCR coå ñieån keát quaû chæ ñöôïc bieát sau khi
taát caû caùc voøng phaûn öùng ñaõ hoaøn thaønh .
Real-Time PCR quaù trình nhaân baûn sao ADN
ñöôïc theo doõi tröïc tieáp theo töøng chu kyø.
Vôùi kyõ thuaät naøy, ADN ban ñaàu ñöôïc ñònh
löôïng moät caùch chính xaùc.
27
Phöông phaùp taïo huyønh quang duøng SYBRGreen
Tín hieäu huyønh quang ñöôïc ño sau giai ñoaïn
keùo daøi cuûa moãi chu kyø PCR
Öu ñieåm reû, ñôn giaûn Nhöôïc ñieåm khoâng
ñaëc hieäu
28
Aùp duïng cuûa PCR
Taïo doøng DNA Tìm hieåu möùc bieåu hieän cuûa
gen (Reverse Transcription PCR) Chaån ñoaùn beänh
(cuûa ngöôøi, suùc vaät, caây coái) Phaùt hieän
ñoät bieán Kieåm tra chaát löôïng (thöïc phaåm,
GMO, oâ nhieãm nöôùc) Phaùt hieän khaùc bieät
giöõa caùc boä gen (Ña daïng gen) aùp duïng
trong noâng nghieäp ñeå choïn loïc caây,
con Daáu aán gen (Tìm cha meï, thuû phaïm vuï
aùn, giaûi ñaùp nhöõng bí maät lòch söû)
29
TÓM T?T QUY TRÌNH TH?C HI?N M?T PH?N ?NG PCR

• Thi?t k? m?i
• Chu?n b? m?u DNA
• Pha mix v?i các thành ph?n theo th? t? sau
• H2O ti?t trùng
• Buffer
• dNTP t?ng s?
• m?i xuôi
• m?i ngu?c
• taq polymerase
• DNA m?u
• Cho vào máy l?p chuong trình ch?y phù h?p
• Ki?m tra s?n ph?m PCR trên gel agarose v?i s? có
  m?t c?a thang chu?n
• Phân tích k?t qu?

30
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
31
Kích thöôùc boä gen cuûa moät vaøi sinh vaät (pb)
  Escherichia coli 4 x
106 Saccharomyces cerevisiae 1,4 x
107 Drosophila melanogaster 1,6 x
108 Caenorhabditis elegans
108 Homo sapiens 3,4 x 109 Arabidopsis
thaliana 108 Oryza
sativa 4,3 x 108 Phaseolus vulgaris (d?u)
2 x 109 Triticum vulgare (lúa mì) 7 x
109 Tulipa 3,5 x 1010
32
Caenorhabditis elegans
Arabidopsis thaliana
Drosophila melanogaster
Tulipa
33
Gi?i thi?u

• Là phuong pháp phân tích da d?ng DNA khuy?ch d?i
  ng?u nhiên, k? thu?t này du?c phát hi?n vào nam
  1990 (Welsh và McClelland William và ctv.). Dùng
  nghiên c?u s? khác bi?t di truy?n c?a nh?ng loài
  khác nhau.
• K? thu?t RAPD d?a trên k? thu?t PCR, b?ng cách s?
  d?ng nh?ng primer ng?n (kho?ng 10 nucleotide) có
  trình t? bi?t tru?c, b?t c?p và nhân b?n ng?u
  nhiên nh?ng do?n DNA có trình t? b? sung v?i
  trình t? c?a các primer

34
Primer RAPD

• Là do?n ng?n oligonucleotide don (10mer) du?c
  t?ng h?p m?t cách ng?u nhiên
• Ð? tìm s? khác bi?t gi?a các loài ngu?i ta thu?ng
  s? d?ng m?t s? lu?ng l?n các m?i ng?u nhiên
• Trên th? tru?ng hi?n nay có r?t nhi?u m?i ng?u
  nhiên du?c t?ng h?p nhân t?o

35
Nguyên t?c

• Dùng k? thu?t PCR, s? d?ng m?i là các s?i
  oligonucleotide don g?m 10 mer có trình t? s?p
  x?p ng?u nhiên
• SV cùng loài s? có ki?u gen hoàn toàn gi?ng nhau,
  s? khuy?ch d?i các do?n DNA có kích thu?c gi?ng
  nhau khi s? d?ng b?t k? m?i ng?u nhiên nào d?
  ch?y PCR.
• SV khác nhau ít nhi?u v? ki?u gen _ da d?ng v?
  sinh hoc, thì v?i m?t s? m?i ng?u nhiên nào dó
  các do?n DNA du?c khuy?ch d?i s? có kích thu?c
  khác nhau.

36
?ng d?ng

• Nghiên c?u da d?ng di truy?n
• Phát hi?n s? liên k?t gi?a gen v?i tính tr?ng
• Thi?t l?p b?n d? di truy?n
• Phát hi?n d?t bi?n

37
Uu di?m

• D? th?c hi?n và d? thành công do không c?n bi?t
  tru?c trình t? b? gene c?a d?i tu?ng c?n nghiên
  c?u, thao tác don gi?n
• Ch?t lu?ng DNA khuôn không c?n d? tinh s?ch cao.
  Th?i gian th?c hi?n nhanh. Kh? nang nhân b?n cao
• Chi phí th?c hi?n th?p.
• s? d?ng k?t h?p v?i nh?ng k? thu?t cao c?p khác
  d? dánh giá da d?ng di truy?n và nh?n di?n ch?
  th? phân t? có d? tin c?y cao

38
H?n ch?

• K? thu?t RAPD có d? chính xác không cao, không ?n
  d?nh
• Kh? nang nhân b?n trong ph?n ?ng PCR cao nhung
  kh? nang xu?t hi?n da hình th?p và d? tin c?y
  không cao
• Kh? nang nh?n di?n ch? th? phân t? th?p và có d?
  tin c?y không cao

39
(No Transcript)
40
S?n ph?m di?n di RAPD
41
Hãy thi?t k? m?i d? khuy?ch d?i do?n DNA sau,
tính Tm c?a m?i?

• 5aagcgtattgatgttcagaataatgaaaccactaattcaagagtattg
  tgtgtatgccttgttatttcttcatgatccaagggtttctcgcgtcaaca
  gtatgttctgagctttttgttgttgtcatatctacttattcatgtttgga
  atgaaatgtcaattgtctcatcttcctaaagtgtatacaagtttttgttc
  tacaatagaactctacaacagctgaatataatgataaaaatagatatttt
  cttggctctttttttcattttacttttcttgacttctcatatggaaccac
  ctccagcaacaaacggacctgttattgcaggttactttgctaattggtaa
  cattgcataacaaaggcaaaaggggagcttaactcaactaactagaatgt
  aataggggaatctacgatagaaaatacaatgttgttgatgtagctactca
  agccaataagttgactcatattttatatgcatttgctaatgtccaaccgg
  atggtcaagttgttcttggggtagtataaattattgcaagatatagaata
  taataataataattataaatataggacgcttatgcagatattgaaaagca
  ttttccagcaagtaaaaaaataataataaacaaatataaaacctctccct
  aattcatacataatatgtagaccaagcagtcaaccgaaaagaagatggat
  ggaatgatccaggcaagaacctttacggtaactttaagcagttctattta
  ctcaagcaacaacaccgtcatctcaaagtgtcgcttagcattggcggata
  tacatggtccactcattttggcccggttgcgcgtgatcctcagaaacgca
  gattgtttgtagatagcagcatcaaacacctagccaacttgggtctggac
  gggctagatattgactgggagtaccccaaagatgatgaggaagcgtttta
  ttatgtgcatctgctctatgagttgcgactggcgcttgacagatatcaac
  aacagtgccaacaactgattcagtcgcgactattactcacagtagccgtg
  ccttgtggccctgaccattatcgtaaattgagattgaccgaaatgcaacc
  ttacgtggacctattttacctcatggcatacgactatgctggttcatggg
  attctttcgcagatcatcaagcggctgtttatggtggcagattgaataca
  gaacaagcagtacagcactatatcgcctgtggtatccctccatataagct
  agtcgtaggcatgcctttatatggtcgaggattctgcaatacggcggggc
  caggtcatcctttccaaggactgcctcgcggtacctgggaagagggtcaa
  tttaattacaagacattgccaaaaccgggcgctgtagaataccacgactt
  taatcgactagcctcatggtcttatgaccctcaggctcgtgaatttatca
  cctatgatactacgagatacattaacgt 3

42
k?t qu?

• M?i xuôi 5 AAG CGT ATT GAT GTT CAG 3
• M?i ngu?c 5 ACG TTA ATG TAT CTC GTA 3
• Tm (m?i xuôi) 4x 7 2 x 11 50
• Tm (m?i ngu?c) 4x 6 2 x 12 48