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RESONANCIA MAGN

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RESONANCIA MAGN TICA NUCLEAR M riam Onrubia Laura Plaza Patricia Resa Resonancia Magn tica Nuclear La RMN es un fen meno que ocurre cuando el n cleo de ciertos ... – PowerPoint PPT presentation

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Title: RESONANCIA MAGN


1
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
  • Míriam Onrubia Laura Plaza Patricia Resa

2
Resonancia Magnética Nuclear
  • La RMN es un fenómeno que ocurre cuando el núcleo
    de ciertos átomos inmersos en un campo magnético
    estático, son expuestos a un segundo campo
    magnético.
  • 1H, 13C, 15N, 31P

3
Características RMN
  • Uso de muestras no cristalizadas ? estructura en
    solución
  • Posibilidad de aplicar a moléculas sin cristales
    disponibles.
  • Amplio rango de condiciones experimentales
  • PDB 16 de proteínas determinadas por RMN
  • Determinación de estructuras de tamaño limitado
    (35-40 KDa)

4
Mecánica Clásica y Cuántica
  • µ momento magnético dipolar
  • B Campo magnético
  • e carga del e-
  • m massa del átomo o e-
  • L S momentos angulares
  • ? cte giromagnética
  • M magnetización
  • ml momento angular de spin

5
Mecánica Cuántica
Niveles cuánticos de la energía en B0
DE
6
Orientación de los spins
B0
7
Población de niveles energéticos
Frecuencia de Larmor
8
Aplicación de B1
B0
B1
9
Relajación
10
Ecuaciones de Bloch
11
Ecuaciones de Bloch
Soluciones
12
Representación de las ecuaciones de Bloch
13
Ecuaciones de Bloch
Soluciones
14
Relajación
T1
  • T1 longitudinal relaxation time o spin-lattice
    relaxation time
  • T2 transverse relaxation time o spin-spin
    relaxation time
  • T2 ? T1

T2
15
Recoger la señal Free Induction Decay (FID)
Señal Función de onda para cada sistema
spin Frecuencias
Transformada de Fourier
16
RNM unidimensional
17
Determinación estructural de proteínas para RMN
  • Proteínas pequeñas (lt 10 kDa)
  • RMN bidimensional basada en experimentos de 1H
  • La estructura se puede obtener sin necesidad de
    enriquecimiento isotópico.
  • Proteínas pequeñas-medianas (lt 20 kDa)
  • Marcaje isotópico (15N i 13C)
  • Experimentos de RMN multidimensionales (3D) de
    triple resonancia (1H/13C/15N)
  • Proteínas grandes (gt 20 kDa)
  • Marcaje isotópico (15N i 13C) deuteración
    (50-70 2H)
  • Experimentos de RMN multidimensionales (3D i 4D)
    de triple resonancia (1H/13C/15N) sofisticados

18
RMN bidimensional
  1. Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y
    NOESY.
  2. Asignación determinar que Aa hay en los
    espectros
  3. Determinación de las distancias entre Aa
  4. Reconstrucción 3D

19
COSY
  • Identifica los sistemas de spin característicos
    de los aminoácidos.
  • Permite, por tanto, identificar los aminoácidos.

20
COSY
CH3-CH2-OH
90º
90º
t1 t2 t3 t4
TF
90º
90º
TF
90º
90º
TF
90º
90º
TF
21
COSY
22
(No Transcript)
23
NOESY
  • Técnica para correlacionar núcleos en el espacio
    que se encuentran a una distancia menor de 5Å.
  • La diferencia entre los espectros con y sin
    efecto NOE da lugar al espectro NOESY. Cuanto
    mayor es el efecto menor es la distancia.
  • Permite la identificación de la posición
    específica de cada aminoácido en la secuencia.

24
Efecto NOE Nuclear Overhauser Effect
  • La irradiación sobre un núcleo produce
    variaciones en la resonancia en los núcleos
    vecinos.
  • Condiciones
  • distancia lt 5Å
  • Saturación de la resonancia

25
RMN bidimensional
  1. Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y
    NOESY.
  2. Asignación determinar que Aa hay en los
    espectros
  3. Determinación de las distancias entre Aa
  4. Reconstrucción 3D

26
Asignación
  • Identificar tipos de Aa en COSY y TOCSY
  • Identificar en NOESY los Aa de la secuencia
  • Desplazamientos químicos en COSY

27
Asignación de los sistemas de spin de los Aa
28
Asignación de los sistemas de spin de los Aa
  • Experimento 2D COSY (COrrelation
    SpectroscopY)
  • Experiment 2D TOCSY (TOtal Correlation
    SpectroscopY)

29
Asignación de los sistemas de spin de los Aa
CHbi
O
CHbi1
O
Ni
Cai
Ci
Ni1
Cai1
Ci1
Ni2
H
Ha
H
Ha
H
picos correlación TOCSY, COSY
30
Asignación de los sistemas de spin de los Aa
31
Asignación de los sistemas de spin de los Aa
  • Experiment 2D NOESY (Nuclear Overhauser
    Effect SpectroscopY)

32
y al final de la asignación ...
33
RMN bidimensional
  1. Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y
    NOESY.
  2. Asignación determinar que Aa hay en los
    espectros
  3. Determinación de las distancias entre Aa
  4. Reconstrucción 3D

34
Determinación de las distancias entre Aa
  • NOE ? distancias
  • NOEs intensos 1.8 lt rHH lt 2.8 Å
  • NOEs medios 1.8 lt rHH lt 3.5 Å
  • NOEs débiles 1.8 lt rHH lt 5 Å

35
RMN bidimensional
  1. Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y
    NOESY.
  2. Asignación determinar que Aa hay en los
    espectros
  3. Determinación de las distancias entre Aa
  4. Reconstrucción 3D

36
Reconstrucción 3D
ángulos diedros
puentes disulfuro
restricciones experimentales
límites de distancias entre 1H
Coordenadas De los átomos de la proteína
Secuencia proteína
Longitudes y ángulos de enlace
quiralidad, planaridad
Interacciones no covalentes van der Waals,
electrostáticas, enlaces dH
37
Estructura de proteínas
enlace
38
Estructura de proteínas
ángulo
enlace
39
Estructura de proteínas
dihedro
ángulo
enlace
40
Estructura de proteínas
dihedro
ángulo
enlace
van der Waals
41
Estructura de proteínas
dihedro
ángulo
enlace

-
electrostático
van der Waals
42
Estructura de proteínas
dihedro
puente de hidrógeno
ángulo
enlace

-
electrostático
van der Waals
43
Estructura de proteínas
puente de hidrógeno

-
electrostático
van der Waals
44
(No Transcript)
45
Fin de la presentación, haga click si tiene dudas
46
Parámetros espectrales con información sobre la
estructura secundaria de la proteína
  • NOE
  • Constantes de acoplamiento (J)
  • Desplazamientos químicos (d)
  • Velocidades de intercambio H D
  • Coeficientes de temperatura

47
Parámetros espectrales con información sobre la
estructura secundaria de la proteína
  • NOE La irradiación sobre un núcleo produce
    variaciones en la resonancia en los núcleos
    vecinos.
  • Condiciones
  • distancia lt 5Å
  • Saturación de la resonancia para igualar estados
    alfa y beta.
  • Es el método de elucidación de características
    estructurales en 3D y estereoquímica, usando RMN
    junto con información de los acoplamientos
    escalares spin-spin.

48
Parámetros espectrales con información sobre la
estructura secundaria de la proteína
  • Constantes de acoplamiento spin-spin (J)
  • Las interacciones escalares entre núcleos unidos
    a través de un pequeño número de enlaces
    covalentes causan desacoplamiento en las señales
    de RMN.
  • Dependen de la geometría de los enlaces que unen
    los spins nucleares.

49
Parámetros espectrales con información sobre la
estructura secundaria de la proteína
  • Desplazamientos químicos (d)
  • Los diferentes protones de una molécula
    presentan frecuencias de resonancia
    característica en función de su entorno químico.

50
Parámetros espectrales con información sobre la
estructura secundaria de la proteína
  • Velocidades de intercambio 1H 2H
  • 5. Coeficientes de temperatura permite saber
    si se forman puentes de hidrógeno
    intramoleculares.

51
1.Cita las características más importantes de la
técnica RMN y su definición. La RMN es un
fenómeno q ocurre cuando el núcleo de ciertos
átomos inmersos en un campo magnético estático,
son expuestos a un segundo campo magnético. Solo
sufren este fenómeno los núcleos que tiene la
propiedad llamada SPIN. Núcleos q tienen esta
propiedad de spin son 1H, 13C, 15N. Solo los q
tienen spin distinto de 0 son detectables por
RMN.   Características - Las estructuras a
estudiar están en solución, como suelen estar en
su medio habitual. - Posibilidad de aplicar a
moléculas sin cristales disponibles. - Amplio
rango de condiciones experimentales. Esto permite
aumentar las posibilidades de estudios
comparativos en soluciones de condiciones
naturales o desnaturalizantes. - También se
pueden estudiar con esta técnica proteínas no
solubles con RMN sólido o con micelas. (para por
ejemplo el estudio de prot. Transmembrana). -
PDB 16 de proteínas determinadas por RMN -
Determinación de estructuras de tamaño limitado
(35-40 KDa)
52
2. En que consiste el efecto NOE y que
aplicaciones podemos encontrarle? Efecto NOE la
saturación de un sistema spin mediante
irradiación producirá variaciones en la señal
emitida por los sistemas spin vecinos. Se basa
en saturar uno de los sistemas spin de la
muestra. Si seguimos irradiando este sistema spin
concreto durante un periodo de tiempo más largo,
este no puede absorber esta energía de más y la
cede a los sistema spin vecinos situados a menos
de 5 amstrongs que sí podrán absorber esta
energía. Comparando las frecuencias obtenidas
habiendo producido o no efecto NOE, podremos
deducir que sistemas spin están a 5 amstrongs o
menos de distancia. Aplicaciones? Experimento
NOESY Nos permite comparar espectros obtenidos
habiendo producido el efecto NOE y sin
producirlo, de manera que podemos comparar que
sistemas de spin quedan afectados por otros
sistemas de spin cercanos. Teniendo en cuenta
que cada aminoácido tienen un sistema de spin
característico, podemos relacionar sistemas spins
vecinos separados por enlaces peptídicos (?doble
enlace), es decir, podemos relacionar aminoácidos
vecinos. Esto nos permite conocer la secuencia de
una proteína.  
53
  • PEM
  • 1. Señala les opciones correctas
  • a)      Solo los átomos con sistema de spin
    diferente de 0 son detectables por RMN.
  • b)      Tienen propiedad de spin los átomos con
    un número de electrones impar y/o con un número
    de neutrones impar.
  • c)      Las dos anteriores son correctas.
  • d)      Cualquier tipo de átomo presenta
    propiedad de spin.
  • e)      Todas las anteriores son correctas.
  •  
  •  
  • 2. Señala las verdaderas. Sobre RMN (Resonancia
    Magnético Nuclear)...
  • Una de las principales ventajas del RMN es que no
    es necesario cristalizar la molécula en estudio.
  • Se pueden hacer RMN en medio sólido.
  • El hecho de que se puedan hacer RMN con micelas,
    permite el estudio de proteínas transmembrana en
    un medio similar al que se encuentran en
    condiciones normales.
  • Uno de los principales inconvenientes es que el
    tamaño de las proteínas que se pueden estudiar es
    limitado.
  •  
  • a)      1, 2 i 3
  • b)      1 i 3
  • c)      2 i 4
  • d)      4.

54
  • 4. Indica la opción correcta. El RMN
    unidimensional nos sirve para...
  •  
  • a)      Determinar si existe mucho solapamiento
    entre frecuencias, indicando si debemos hacer RMN
    3D.
  • b)      Se usa como indicativo de la calidad que
    tendrá el estudio en 2D.
  • c)      Indica frecuencias y su posición depende
    del desplazamiento químico.
  • d)      Todas las anteriores son correctas.
  • e)      Ninguna de las anteriores es correcta.
  •  
  •  
  • 5. Señala la afirmación incorrecta
  • a)      Las ecuaciones de Bloch describen la
    relajación del sistema de spin al dejar de
    aplicar el segundo campo magnético
  • b)      La frecuencia a la que precesan (giran)
    los sistemas de spin es completamente
    irrelevante.
  • c)      El nivel energético en el que se
    encuentre un átomo sometido a una campo magnético
    depende del momento angular de spin.
  • d)      El momento magnético bipolar (?) es
    directamente proporcional a la carga e
    inversamente proporcional a la masa.
  • e)      Todas las anteriores son correctas.
  •  
  •  
  •  

55
  •  
  • 7. Indica las verdaderas.
  • a)      Un experimento NOESY proporciona más
    información que uno COSY.
  • b)      El primer paso del análisis de los
    resultados de los experimentos de RMN es la
    asignación ( saber cada sistema de spin a que
    aminoácido corresponde).
  • c)      Las dos anteriores son correctas.
  • d)      El experimento NOESY nos proporciona las
    restricciones de distancia entre amnoácidos, de
    manera que es el que realmente nos da la
    información sobre la estructura secundaria y
    terciaria de la proteína.
  • e)      Todas las anteriores son correctas.
  •  
  • 8. En el experimento NOESY
  • 1.      Dado que las proteínas tienen cierto
    movimiento en solución, las distancias no van a
    ser números exactos
  • 2.      La lista de distancias obtenidas con un
    NOESY va a ser esencial para hacer la
    reconstrucción 3D.
  • 3.      Se utilizan una serie de rangos para
    definir las distancias entre sistemas de spin, el
    mínimo de los cuales coincide con la suma de los
    radios de las fuerzas de Van der Wals.
  • 4.     Cuanto más intenso sea el pico obtenido en
    un espectro NOESY, más lejos están los
    aminoácidos implicados.
  •  
  • a)     1, 2 i 3
  • b)     1 i 3
  • c)      2 i 4
  • d)     4
  • e)      1, 2, 3 i 4

56
  •  
  • 10. En cuanto a la asignación en RMN
  •  
  • 1.      Con los espectros de COSY identificaremos
    qué y cuántos aminoácidos hay en nuestra proteína
    problema.
  • 2.      El NOESY nos permitirá determinar los
    aminoácidos vecinos por estructura y por
    secuencia.
  • 3.      El NOESY es útil para distinguir entre
    hélices alfa y beta.
  • 4.      Cada aminoácido tiene una distribución de
    picos característica en un espectro COSY.
  •  
  • a)      1, 2 i 3
  • b)      1 i 3
  • c)      2 i 4
  • d)      4.
  • e)      1, 2, 3 i 4
  •  
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