1
Özel Konakta Infeksiyon Etkenlerin Saptanmasi
Viruslar

• Doç. Dr. Murat Günaydin
• Ondokuz Mayis Üniversitesi Tip Fakültesi
• Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD.

2
Virolojik Tani Metotlari

• Direkt inceleme
• Indirekt inceleme
• Serolojik yöntemler

3
Direkt Inceleme
Antijen gösterme Immunfloresan, ELISA vb.
Elektron mikroskobisi Virus morfolojisi, Immun elektron mikroskobisi
Isik mikroskobisi Histolojik görünümler, Inklüzyon cisimcikleri
Viral genomu gösterme Spesifik nükleik asit problari ile hibridizasyon, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), vd.
4
Viral Antijenlerin Gösterilmesi ile Hizli Viral
Tani

• Immunfloresan testler
• Avantaj
• Kisa sürede sonuç (bir kaç saat)
• Sorunlar
• Duyarlilik hücre kültürüne göre oldukça düsük
• Özgüllük daha zayif
• Numune kalitesi önemli
• Prosedürler sikici ve zaman alici

5
Moleküler Teknikler

• Viral genomun gösterilmesine dayali testlerdir
• Duyarlilik ve özgüllükleri çok iyidir
• Rutin viroloji laboratuarlarinda konvansiyonel
  metotlara göre hala sinirli kullanilmaktadir
• Bir çok laboratuara moleküler metotlar hizla
  yerlesmektedir. Viral tanida her geçen gün önemi
  artmaktadir

6
Moleküler Teknikler

• Klasik moleküler teknikler
• Dot-blot, insitu hibiridizasyon ...
• Özgüllük hibridizasyon sartlarina bagli degisir
• Duyarlilik konvansiyonel metodlardan daha iyi
  degil ve pahali
• PCR
• Hedef DNA sekanslarinin invitro spesifik
  çogaltilmasi
• Duyarlilik ve özgüllük çok iyi

7
Diger Moleküler Teknikler

• bDNA duyarli bir hibridizasyon teknigidir, linear
  bir çogalma saglar
• LCR, NASBA, TMA gibi teknikler signal yada hedef
  çogaltma temeline dayanirlar
• Duyarlilik klasik teknikler ile PCR arasindadir
• Diger moleküler teknikler amplifikasyonun sekline
  bagli olarak degisir
• DNA chip teknolojiside son dönemde populer
  olmustur. Birçok virusu ayni anda arastirmayi,
  hatta ayni anda ilaç direnç durumunu ortaya
  koyabilmektedir

8
Indirek inceleme
Hücre kültürü Sitopatik etki (CPE) Hemabsorpsiyon Immunfloresan
Embriyonlu yumurta CAMda pocks Hemaglütinasyon Inklüzyon cisimcikleri
Hayvan deneyleri Hastalik Ölüm
9
Hücre Kültürü

• Klasik hücre kültürü
• Sitopatik etki, hemadsorbsiyon
• Süre uzun (? 4 hafta)
• Numune kalitesine bagli duyarllik ve özgüllük
• Kontaminasyon, yoksik maddelerden etkilenme
• Her virus için uygulanamaz
• Hizli hücre kültürü
• Shell vial
• Kültürde viral antijenlerin 2-4 gün sonra
  gösterilmesi esasina dayanir
• Daha hizli ve özgül

10
Seroloji
Klasik teknikler Yeni teknikler
Kompleman fiksasyon testi Radioimmun assay (RIA)
Hemaglütinasyon inhibisyon testi Enzim immun assay (ELISA)
Immunfloresan teknikler Partikül aglütinasyon
Nötralizasyon testleri Western blot (WB)
Counter immun elektroforez RIBA, Line immun assay
11
Seroloji

• Serolojinin yarari, virusa bagli olarak
  degisebilir
• Respiratuar viruslarda oldugu gibi birçok virus
  infeksiyonunda, klinik hastaliktan sonra
  antikorlar ortaya çikar.
• Serolojik tani genellikle retrospektif olarak
  konur ve bu nedenle bu tür hastalarda kullanisli
  degildir
• Akut ve konvelasan dönem serum örneklerinin
  birlikte degerlendirilmesi için uzun bir süreye
  ihtiyaç vardir
• Benzer viruslarda antijenik çapraz reaksiyon,
  dolaysiyla yanlis pozitiflik

12
Serolojide kriterler

• Primer infeksiyon tanisinda kriterler
• Akut ve konvelasan dönemler arasinda IgG veya
  total Antikor titresinde en az 4 kat artis
• Tek ölçümde IgG veya total Antikor titresinin çok
  yüksek olmasi- çok güvenli degil
• IgM cinsi antikorlarin gösterilmesi
• Serokonversiyon
• Reinfeksiyon tanisinda kriterler
• Akut ve konvelasan dönemler arasinda IgG veya
  total Antikor titresinde en az 4 kat artis
• IgM antikorlari yoktur yada çok düsük düzeydedir

13
Akut infeksiyondan sonra tipik profil
Reinfeksiyon esnasinda IgM ya yoktur ya da çok
düsük seviyelerdedir
14
Viral infeksiyonlar

• Organ transplantasyonlarindan sonra ve immun
  supresyon durumlarinda viral infeksiyonlar
  firsatçi ajanlar olarak karsimiza daha sik çikar
• Selim seyreden viral infeksiyonlarin çogu daha
  agir ve ölümcül seyreder

15
Viral Infeksiyon

• Transplantasyon sonrasi
• Ilk ay
• Nozokomiyal infeksiyon
• 1-6 ay
• Firsatçi infeksiyonlar
• gt 6 ay
• Toplumdan kazanilmis infeksiyonlar

16
Viral Infeksiyonlar
17
Viral infeksiyonlar

• Bir çok viral etken için kullanilabilecek ajan
  mevcuttur.
• Toksik etkileri nedeni ile dogru kullanimlari
  gereklidir
• Hastaligin çikisini önleme
• Hastaligin gidisini kontrol
• Hizli ve dogru tani yöntemleri
• Özellikle solunum yolu infeksiyonlarinda
• Gereksiz antibiyotik kullanimi

18
Viral infeksiyonlar

• Özel viral infeksiyonlar
• En önemli infeksiyon etkeni
• Cytomegalovirus
• Transplantasyon olgularinin 2/3ünde etken
• 1-4 ayda sik
• Immunosupresif tedavi
• Son dönemde önem kazanan ajanlar
• Solunum yolunun viral patojenleri

19
CMV

• Transplant hastalarinda ve immun yetmezligi
  olanlarda ciddi hastaliklara ve ölümlere neden
  olabilmektedir
• CMV infeksiyonu
• Semptom olmaksizin örneklerden virusun bulunmasi
• CMV hastaligi
• Infeksiyon ile birlikte semptomlarin eslik
  etmesidir

20
CMV tani yöntemleri

• Histoloji ve sitoloji
• Hücre kültürleri
• Konvansiyonel
• Hizli hücre kültürleri
• Antijenemi testleri
• Nükleik asit göstermeye dayali teknikler
• PCR ve Hibridizasyon yöntemleri
• mRNA saptama yöntemleri
• NASBA (nucleic asid sequence-based amplification)
• Seroloji

21
CMV Hücre Kültürü

• Konvansiyonel hücre kültürü
• CPE geç olusur
• Kullanim için uygun degildir
• Direnç için kullanilabilir
• Hizli hücre kültürü
• Monoklonal antikorlarla viral antijenlerin 24-48
  saat içinde gösterilir
• Buffy coat daha erken pozitiflesir
• Idrar ve orofaringeal örneklere göre daha
  degerlidir

22
CMV Hücre Kültürü

• Hizli kültür teknigi
• Belirli sayida lökosit inokülasyonu
• Kantitatif sonuç
• Antiviral yanit izlenebilir
• Lökositler hücrelere toksik etkili
• Duyarliligini azaltmaktadir
• 24-48 saat içinde viremide belirgin azalma
• CMV antiviral ajana duyarli
• 48 saatten sonra viremi devam ediyor
• CMV antiviral ajana dirençli?

23
CMV IFA

• A Hücre kültürlerinde exprese edilmis CMV
  antijenleri hizli immunflorosan boyama teknikleri
  ile monokonal Ab kullanilarak gösterilebilir
  (insan fibroblasts hücrelerinin çekirdeklerinde,
  CMV early antijen)
• B Buffy coat kullanilarak fibroblastlar CMV ile
  infekte edilmis (CMV early antijenine karsi
  olusmus monoklonal antikor ile direkt
  boyanmmistir.

24
CMV Antijenemi testi

• Periferik kan lökositlerinde antijen pozitifligi
• Aktif CMV infeksiyonu
• Antijenemi düzeyine göre preempitif tedaviye
  baslamaya karar verilebilir
• lt50/2105 düzeyi
• Asemptomatik infeksiyon
• Antijenemi düzeyi izlenmelidir
• ?100/2105 düzeyi
• Semptom aranmaksizin tedaviye baslanir.
• Direnç yoksa
• Antijenemi testi tedavi sonrasinda negatiflesir.
• Tedavinin ilk haftasinda antijen düzeyi
  artabilir
• Direnç olarak degerlendirilmemelidir

25
CMV Antijenemi testi

• Belli sayida lökosit içersinde antijen pozitif
  hücrelerin sayimi
• Viral yük kantitatif olarak saptanabilir
• Antijenemi saptayan yöntemler
• Hücre kültüründen daha duyarlidir,
• Hastalik bulgulari ortaya çikmadan kültürden 7-14
  gün daha önce saptanabilmektedir
• PCRa yakin bir duyarliliga sahiptir
• Lökositlerin düsük oldugu durumlarda PCR tercih
  edilir

26
CMV Antijenemisinin Gösterilmesi

• Nötrofillerdeki CMV pp65 matrix proteinini
  gösterme
• Kahverengi olarak peroksidaz ile boyanmis
• Bu antikorlarla boyanmis Pozitif hücre sayisi
  infeksiyonun siddeti ile dogru orantili

27
CMV Nükleik Asit Hibridizasyon

• Kantitatif sonuç verilebilir
• Hibrid yakalama CMV DNA testi (700 kopya/ml)
• bDNA sinyal amplifikasyon testi (900/106
  lökosit)
• Viral yükün düsük oldugu durumlarda izlem için
  uygun degildir,
• bDNAnin kullanimi lökopenik olgularda sinirlidir

28
CMV Kalitatif PCR

• CMV PCR pozitifligi akut infeksiyonu gösterir
• Lökosit, serum ve plazma örneklerinde
• Kalitatif ve kantitatif çalisilabilir
• Kalitatif PCR ? negatif
• Seronegatif ve seropozitif hastlarda CMV negatif
• Kalitatif PCR ? pozitif
• Seronegatif olgularda CMV infeksiyonu
• Yüksek duyarlilik
• Kalitatif çalismalarda seropozitif hastalarda
  latent virusun saptanmasina neden olabilir

29
CMV Kantitatif PCR

• Latent/aktif infeksiyon ayiriminda
• Tedavinin izlenmesinde
• Periyodik testlerde viral yükün artmasi tedavi
  endikasyonu kabul edilir
• Tedavi bitiminde testler negatiflesmeli veya
  viral yük belirgin oranda azalmalidir
• Aksi dirence isaret eder
• Ticari, kantitatif, standardize
• Cobas amplicor CMV monitor testi
• Duyarliligi gt400 kopya /ml
• Yeni, kullanisli, hizli testler
• Real-time PCR

30
CMV mRNA saptama

• CMVnin yapisal proteinlerini kodlayan genler
• Aktif infeksiyon sirasinda transkripte edilir
• Spesifik mRNA dizilerinin saptanmasi aktif
  infeksiyonu gösterir
• IE-mRNA, E-mRNA, L-mRNA
• Buna yönelik RT-PCR ve NA sekans esasli
  amplifikasyon testleri yapilabilir (NASBA)
• Ticari olarak mevcut olan bu test de
  standardizedir
• Kalitatif olarak sonuç verir, ancak geç
  proteinlerden biri olan pp67 mRNA dizilerinin
  arastirilmasi hem aktif CMVyi göstermede hem de
  tedaviye yaniti takipte denenebilir

31
CMV Seroloji

• Transplant hastalari için uygun degildir
• Serolojik testler aktif infeksiyonu göstermede
  yetersiz kalir
• IgG antikorlari geçirilmis infeksiyonu gösterir
• IgM akut infeksiyonu göstermesi beklenir,
• Ancak degisik zamanlarda da pozitif saptanabilir
• Çapraz reaksiyonlar taniyi karistirabilir
• Avidite testleri denenebilir

32
CMV Flow Sitometri

• CMV antijenleri çok erken ve duyarli olarak bu
  yöntemle saptanabilir
• CMV DNA floresan insitu hibridizasyon teknigine
  uyarlanarak duyarlilik artirilabilir
• CMVe karsi olusmus spesifik sitotoksik T
  lenfositler saptanabilir ve taniya farkli bir
  boyut getirebilir

33
CMV Sonuç

• Yeni gelisen teknikler
• Dogru ve zamaninda tedavi
• Mortalite de düsme
• Transplant sonrasi
• CMVnin en sik görüldügü ilk 4 ayda
• Kantitatif sonuç veren testlerden biriyle haftada
  1 izlenmelidir.
• Iki farkli testin kullanimi maliyet göz ardi
  edilirse duyarliligi artirabilir

34
Solunum Yolu Viral Ajanlari

• Immunkomprimise hastalarin solunum yolu
  infeksiyonlarinda viral ajanlar özellikle son
  dekadda dikkat çekmektedir
• Viral infeksiyonlarla birlikte ölüm riski
  artmaktadir
• Toplumdan kazanilmis yada nozokomiyal
  pnömonilerde
• RSV
• Influenza virus,
• parainfluenza virus
• Adenovirus
• Picornaviruslar

35
Hücre kültürü

• Hücre kültürü altin standart dir
• Hizli tani için uygun degil (2-10 gün)
• Klinik degeri sinirli
• Hep-2C, R-HELA, t-MK
• Kültürlerde haftada 2 kez sitopatik etki gözlenir
• Pozitif kültürlerde, immunfloresan testlerle
  monoklonal antikorlar kullanilarak tanimlama
  yapilir

36
RSV Hücre Kültürü

• Hep-2 hücre kültüründe RSVye bagli sitopatik
  etki.
• Sinsutyum olusumu
• Immunperoksidaz metotla boyanmis

37
Viral Antijeni gösterme

• Immunfloresan testler
• Bir kaç saat içersinde sonuç alinabilir
• Hücre kültürüne göre duyarlik düsüktür
• Özgüllük her zaman yeterli olmaz
• Her virus için kit bulunmayabilir

38
RSV IFA

• Nasal yikama suyu RSVe karsi olusmus bovine
  antikorla boyanmistir
• Infekte mononükleer hücrelerin sitoplazmasinda
  görülen yesil boyanma pozitifligi gösterir

39
PCR

• Duyarli ve özgül
• Single veya multiplex PCR
• Nested RT-PCR
• RSV
• Parainfluenza virus 1-3
• Influenza virus A ve B
• Rhinovirusler
• Enteroviruslar
• Coronaviruslar

40
PCR

• Influenza A ve B
• (Amatrix protein, Bhemaglütinin geni)
• Parainfluenza 1-3
• (hemaglutinin nöraminadaz glikoproteini)
• Picornaviruslar (Rhino ve enteroviruslar)
• (5 nonkoding bölge)
• RSV A ve B
• (nukleokapsid proteini)
• Coronavirus
• (nukleokapsid proteini)

41
PCR

• BALin üst solunum yolu florasi ile
  kontaminasyonu
• Bu tür hastalar uzun süre virus salarlar
• Hizli ve duyarli yöntemlere ihtiyaç vardir
• Moleküler yöntemler klasik yöntemlere göre
  solunum yolu virus tayin hizi ve oranini büyük
  ölçüde artirmistir
• Sonuçlarin klinik degeri?
• Daha fazla çalismalara ihtiyaç vardir

42
Seroloji

• Çift serum örnegi ile yapilacak çalismalarda
  titrede en az 4 kat artis aranir
• Kompleman fiksasyon testi
• RSV, influenza A ve B, Parainfluenza 1-3,
  Adenovirus
• Indirekt immun floresan
• RSV, Influenza A ve B

43
Solunum Yolu örnekleri

• Bronkoalveolar lavaj (BAL), Burun Bogaz sürüntüsü
• Viral transport mediuma,
• En kisa sürede laboratura gönderilir, maksimum 24
  saat 4oCde bekletilebilir
• Laboratuvara gelen materyalin Materyalin bir
  kismi viral kültür ve/veya antijen çalismalari
  için kullanilir
• Kalan kismi 70oCde saklamaya alinir,
• Çift serum örnegi alinir

44
EBV Tani

• Monospot testi
• 10-15 negatif
• VCA-IgG
• Akut, geçirilmis
• VCA-IgM
• Primer EBV infeksiyonu (1-2 ay pozitif)
• EA karsi Ab
• Akut infeksiyon
• NA karsi Ab
• Geçirilmis infeksiyon

45
VZV Tani

• Transplant öncesi seroloji bilinmeli
• Hücre kültürü
• Tzank preparat
• Hibridizasyon
• PCR

46
HSV

• Biopsi
• Direkt immunofloresan
• Tzank testi
• Kültür
• Seroloji
• Primer infeksiyon tanisinda yardimci