II - Visualiser les mol

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II - Visualiser les molécules dans les cellules
vivantes
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Généralités

• Techniques de microscopie optiques (les moins
  traumatisantes)
• Marquage fluorescent des molécules à suivre

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Concentrations ioniques

• Microélectrodes (H, Na, K, Cl-, Ca) mais pas
  rapide
• Indicateurs sensibles aux ions
• luminescents (aequorine de la méduse)
• fluorescents

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Fig 9-38

• Aequorine protéine luminescente en fonction de
  Ca libre entre 0,5 et 10 ?M
• injection d'aequorine puis
• fécondation
• photo toutes les 4 secondes
• Libération de Ca dans le cytoplasme
• Mais très faible intensité

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Fig 9-39

• Cellule de Purkinje
• Indicateur fluorescent sensible à Ca (fura-2)
• Ca intra cellulaire en fluorescence
• rouge forte Ca (dendrites)
• bleu faible Ca

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Autres indicateurs fluorescents

• Autres ions

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Injection intra-cytoplasmique de molécules
marqueur

• Anticorps
• Protéine cellulaire purifiée marquée
• Exemple tubuline

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Fig 18-21 tubuline
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Fig 16-12 tubuline
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Injection intra-cytoplasmique de molécules pour
bloquer une fonction

• Anticorps anti myosine-II dans un œuf d'oursin
  bloque la division sans bloquer la mitose

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Quatre méthodes d'introduction de molécules dans
la cellule

• Microinjection
• Électroporation
• Vésiculation
• Projection à haute vitesse

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Fig 9-40 (AB)
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Fig 9-40 (CD)
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Molécules captives

• Synthèse d'une forme inactive de la molécule
• Introduction dans la cellule
• Activation à un temps et moment donné par un
  faisceau lumineux
• eg molécules captives pour Ca, AMPc, GTP, IP3

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Fig 9-41 Caged molecules

• La molécule X devient active après le flash d'UV

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Application

• Molécules fluorescentes piégées
• Grosse modification de la molécule qui doit
  rester active ? grosse difficulté ?
• Tâtonnement pour créer de nouvelles molécules
• eg tubuline

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Fig 9-42 Caged tubuline fluorescéine
Avant UV
Après UV juste à gauche de la plaque métaphasique
Après 1,5 mn
Après 2,5 mn

• Tubuline rhodamine (rouge)
• Dapi ADN (bleu)
• Tubuline flourescéine piégée (mélangée aux autres
  et invisible avant le rayon d'UV)

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(No Transcript)
19
(No Transcript)
20
(No Transcript)
21
(No Transcript)
22
Desai,A1998
23
(No Transcript)
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Green Fluorescence Protein
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Fig 9-43 GFP
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GFP 3D
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GFP Topol

• GFP

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GFP mice
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Fig 9-44 GFP tagging
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GFP
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Fig 9-45 Dynamics of GFP tagging
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III - Culture cellulaire

• Isolement
• Séparation (FACS)
• Culture primaire et secondaire
• Milieu de culture
• Lignée cellulaire
• Transformation
• Congélation
• Clone
• Hybride

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Facs
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Hybride cellulaire
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Production AC monoclonaux
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Culture SEM
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ME Immuno-gold
Immuno gold en ME
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Pistage de molécules dans la cellule

• Pulse-chase
• Patch-Clamp
• Molécules  piégées 
• Les anticorps
• immunofluorescence directe
• immunofluorescence indirecte

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Fig 9-46
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Fig 9-47
Autoradiographie en microscopie électronique
5 mn de pulse de 3HLeucine dans cellules B de
pancréas
Après 10 mn de chasse
Après 45 mn de chasse
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Fig 9-48
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IV - Fractionnement des cellules et analyse des
molécules

• Techniques biochimiques