Introduction lutilisation du spectromtre de masse MALDIToF Voyager DEPro Applied Biosystems

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Introduction à l utilisation du spectromètre de
masse MALDI-ToF Voyager DE-Pro(Applied
Biosystems)
- Réalisé par Sébastien Gaffé -
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Cette présentation succincte a pour objectif de
donner une vue générale de la SM MALDI et de
l interface du spectromètre.
Les protocoles relatifs à l utilisation du
MALDI sont répertoriés dans le rapport de David
Cosquer  Modes Opératoires Normalisés et
Formulaires du Spectromètre de Masse MALDI-ToF
Voyager DE-Pro  disponible en salle de
Spectrométrie de Masse de l U413. (voir Jérôme
Leprince)
La partie  calibration  est directement
inspirée de ce rapport.
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Principe de la MS
Technique spectroscopique très sensible.
L analyse se déroule en plusieurs étapes. Dans
un premier temps, la source d ionisation forme
des espèces mono ou multi chargées (positivement
ou négativement) en phase gazeuse. Puis un ou
plusieurs analyseurs de masse permettent de
mesurer sous un vide poussé les abondances
relatives des ions produits en fonction de leur
rapport masse de l ion / nombre de charge noté
m/z (en Thompson Th). Ces ions sont ensuite
détectés et après un traitement informatique, on
obtient un spectre de masse de la substance
analysée qui représente l intensité relative des
ions en fonction de leur rapport m/z.
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MALDI-ToF
Une Matrice Assiste le Laser pour Desorber et
Ioniser l échantillon afin de déterminer son
temps de vol (Time of Flight) donc de mesurer sa
masse moléculaire (M) ici, les molécules portent
majoritairement une charge positive (Z1 --gt
protonnation)
Généralement, l échantillon protéique est
préalablement digéré par la trypsine qui génère
un mélange de peptides en solution. Le MALDI va
fournir une cartographie peptidique donnant la
masse des peptides libérés (peptide mapping).
L étude de protéines entières est également
réalisable.
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Matrice Ionisation
Hillenkamp et Tanaka 1988
Un échantillon solide, dispersé dans une grande
quantité de matrice est irradiée par des photons
émis par un laser dont la longueur d onde est
située dans la bande d absorption de la matrice.
L irradiation de la matrice et de l échantillon
va provoquer la création d une grande quantité
d énergie dans la phase condensée, par
excitation électronique des molécules de la
matière. Des ions, formés par transfert de
protons ou d électrons entre matière
photo-excitée et l échantillon analysé désorbent.
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Digestion tryspsique ou Protéines entières
1 µl
1 µl
Dépôt sur cible MALDI ( Dried Droplet )
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Préparation de la Matrice
La matrice employée ici (et le plus communément
en analyse protéomique) est l acide
a-cyano-4-hydroxy cinnamique (a-CHCA). Elle va en
fait co-cristalliser avec l échantillon. Elle
doit toujours être préparée extemporanément
auquel cas elle générera du bruit de fond dans
les spectres. La matrice, pesée, est reprise dans
50 ACN / H2O / 0.1 TFA. - A 10 mg/ml la
solution est saturée - Elle peut être parfois
diluée jusqu à 2 fois à 5mg/ml afin
d améliorer le rapport signal bruit et la
sensibilité - Ici, solution à 7.5 mg/ml
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Dépôt sur cible MALDI
L échantillon en solution est déposé sur une
plaque métallique en présence d une solution de
matrice. Il existe différents types de dépôts
selon la nature de l échantillon. Dans notre
cas, échantillon et matrice sont déposés puis
mélangés à raison de 1 µl chacun sur la cible
MALDI selon la technique de  goutte séchée 
(Dried Droplet).
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Quelques règles de qualité...

• La matrice doit être aussi pure que possible
• L échantillon doit être en solution
• L échantillon et la matrice doivent être dans
  des solutions miscibles
• L échantillon ou sa solution ne doit pas
  empêcher la cristallisation de la matrice
• La plaque doit être propre et pas du tout
  graisseuse

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Entretien de la plaque MALDI

• La durée de vie de telles plaques est
  importanteà condition d en prendre soin !
• Le nettoyage se fait à savon doux (pas de
  détergent) rincé à l eau dé-ionisée puis à
  l eau stérile Milli Q.
• La plaque est ensuite placée au bain à ultrasons
  et passée successivement à l éthanol 100
  pendant 10 minutes, puis 50 et pour finir 5.
• La plaque est enfin mise à sécher à l étuve.

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Dépôt des calibrants
La calibration du spectromètre peut se faire de 2
façons

• Calibration interne ce sont des contaminants
  connus comme la cytokératine, la matrice elle
  même (à vérifier aux alentours de 1060,??), ou
  bien encore les ions issus de l autoprotéolyse
  de la trypsine (fragment 100-107, Mr 842.51 Da
  fragment 56-75, Mr 2163.06 Da).
• Il est également possible de mélanger à
  l échantillon un mix de calibrants du commerce.
• On considère qu il faut au moins 4 points pour
  une bonne calibration.
• La précision admise en interne est de 50-90 ppm

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Dépôt des calibrants (2)

• Calibration externe Les spectres sont calibrés
  en externe avec les ions MH d étalons du
  commerce (ex peptide mix4).

Rq Calibration en soleil
Précision 100 - 200 ppm
NB Il existe différents types de mélanges de
calibrants (CalMix) selon la zone de calibration
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Acquisition des spectres de Masse

• MALDI-ToF Applied Biosystems Voyager DE-Pro
• Logiciel Voyager (AB)
• Logiciel Data Explorer (AB)

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Avoir le bon réflexe...
Le MALDI est un appareil coûteux possédant des
éléments sous vide plus ou moins poussé sous
l impulsion de turbopompes. Une bonne séparation
passe toujours, certes, par une bonne préparation
d échantillon, mais aussi par la mise en route
optimale du spectromètre. Il y a donc un réflexe
à avoir, celui d observer les valeurs de vide
(10-7, 10-8) - au niveau de la source - au
niveau du miroir Il faut bien attendre environ
30 minutes au démarrage de l appareil avant que
les valeurs de vide soient stabilisées. De même,
lorsque l on accède au tiroir de la plaque MALDI
(15 ).
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Linterface du MALDI (Voyager Control Panel)
Voyager Control panel
Echantillon
Données Instrument / Analyse

• Indexation, stockage
• des données

• Mode
• - linéaire (gt6000 Da)
• - réflectron (lt6000 Da)
• Voltage
• Délai d extraction

Acquisition en cours
S
Cumulatif

• Localisation de la plaque

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Acquisition d un spectre de Calibrants
Il existe des méthodes standard optimisées pour
différents domaines de masse, selon que l on
soit en mode linéaire ou reflectron.
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Acquisition d un spectre de Calibrants (2)
NB En mode reflectron, pour obtenir une
précision optimale, il vaut mieux éviter de se
déplacer avec le joystick pendant l acquisition.
Il est préférable de démarrer l acquisition, se
déplacer pour trouver un bon signal, puis arrêter
et enfin relancer une acquisition (mais sans
bouger le joystick) avant d enregistrer.
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Acquisition d un spectre de Calibrants (3)
Enregistrer le spectre lorsque celui-ci a un
signal correct, c est-à-dire non saturé (lt
6.4.104), idéalement aux alentours de 10 000, un
rapport signal/bruit correct et une résolution
acceptable (en général supérieure à 7500). Se
référer au manuel d utilisation User Guide chap.
5.4
Intensité du signal
Intensité relative ()
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Calibration manuelle dans Data Explorer
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Calibration manuelle dans Data Explorer (2)
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Acquisition d un spectre calibré
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Analyse des Spectres
13/
Depuis le Control Panel, ouvrir Data
Explorer Le traitement du spectre peut alors
être opéré. Ex Process/Baseline
Correction/Removal Noise afin de filtrer/lisser
le spectre et ôter le bruit de fond important.
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Ejection de la plaque MALDI