Diapositiva 1

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ANÀLISI INSTRUMENTAL AVANÇAT
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7. Luminescència molecular Luminescència
molecular. Fonaments de la luminescència
Fluorimetria i fosforimetria. Espectres
dexcitació i demissió. Variables que afecten a
la luminescència. Relacions quantitatives.
Instrumentació. Aplicacions. Quimioluminescència.

7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Aplicaciones
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Aplicaciones
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Aplicaciones
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Quimioluminiscencia
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Medida de Quimioluminiscencia

• Características
• Instrumentación muy sencilla recipiente de
  reacción tubo fotomultiplicador!!!!!
• Reacción alcanza rápidamente un máximo cuando la
  mezcla del analito y el reactivo es completa
• Se analiza por tanto patrones y muestra a un
  tiempo fijo

7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Quimioluminiscencia. Análisis de gases
Características Método muy sensible para
contaminantes atmosféricos como ozono, óxidos de
N y compuestos azufrados
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Quimioluminiscencia. Análisis de gases
Características Método muy sensible para
contaminantes atmosféricos como ozono, óxidos de
N y compuestos azufrados
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Quimioluminiscencia. Análisis de especies
inorgánicas en fase líquida
Características Utilizan sustancias
quimiolumiscentes orgánicas que contienen el
grupo funcional Útil para oxidantes
fuertes Ejemplo Luminol
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Quimioluminiscencia. Análisis de especies
inorgánicas en fase líquida
Características Luminol para sangre La Hb
cataliza la reacción, se usa H2O2 como oxidante
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Quimioluminiscencia. Análisis de especies
orgánicas acopladas a una reacción enzimática
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Quimioluminiscencia. Análisis de especies
orgánicas acopladas a una reacción enzimática
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Técnicas de Amortiguación (Quenching) de
Fluorescencia
Características Amortiguacion (Quenching) es
cualquier proceso que disminuye la intensidad de
fluorescencia (población en el estado excitado o
tiempo de vida del estado excitado) de una
muestra. Una reducción del tiempo de vida
implica una disminución del rendimiento quántico.
Este tipo de proceso permiten utilizar las
medidas de fluorescencia para determinar
compuestos que no emiten
En general existen dos tipos de
quenching Estático Dinámico (o
colisional) Ambos procesos ocurren sin que se
verifiquen cambios permanentes en la molécula,
p.e. sin reacción fotoquímica
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Técnicas de Amortiguación (Quenching) de
Fluorescencia
Características del Quenching Estático ? El
quenching estático tiene lugar cuando el quencher
(Q) forma un complejo estable con el fluoróforo
en el estado fundamental y dicho complejo es
inherentemente no-fluorescente. ? A menudo, el
fluoróforo restante no complejado emite
normalmente con el mismo rendimiento quántico y
tiempo de vida que en ausencia de quencher. ?
El quenching estático provoca cambios tanto en el
espectro de excitación (absorción) como en el de
emisión.
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Técnicas de Amortiguación (Quenching) de
Fluorescencia
Características del Quenching Dinámico ? Proceso
que implica colisiones entre el estado excitado
del fluoróforo y otras moléculas (quenchers) que
dan lugar a una perdida de energía de excitación
como calor, o favoreciendo el cruce entre
sistemas, en vez de cómo luz emitida. ? Este
proceso siempre se verifica en alguna medida en
muestras en disolución. ? Las especies que son
particularmente eficientes en inducir este
proceso se denominan quenchers colisionales (p.e.
ion ioduro, oxigeno molecular, radical
nitroxido). ? El quenching estático tiene lugar
cuando el quencher (Q) forma un complejo estable
con el fluoróforo en el estado fundamental y
dicho complejo es inherentemente no-fluorescente.
La concentración de quencher se puede relacionar
con la intensidad de fluorescencia usando la
ecuación de Stern-Volmer. M ? M h?1 KF
Fluorescencia M Q ? M Q Calor KQ Quenching
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Técnicas de Amortiguación (Quenching) de
Fluorescencia
Características del Quenching
La fluorescencia medida es proporcional al
rendimiento cuántico
a. fluorescencia kF
b. conversión interna kIC c. conversión
externa. kEC d. disociación kD e.
predisociación kPD f. cruzamiento entre
sistemas kI
Sin Q
Con Q
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Técnicas de Tiempo de Vida de Fluorescencia
?Tiempo promedio que permanece la molécula en el
estado excitado. Normalmente, es un decaimiento
exponencial con lo que el Tiempo de Vida se
corresponde con el tiempo para el cual el 63 de
las moléculas han vuelto al estado fundamental
(t t). ? La IF en ese momento es de 1/e del
valor original. El decaimiento de la intensidad
de fluorescencia con el tiempo vendrá dado por la
siguiente expresión
El fenómeno de amortiguación se puede estudiar
mucho mejor utilizando mediadas de tiempo de vida
ya que nos permitirá distinguir con facilidad si
la amortiguación es dinámica o estática. La
formación de complejos en el estado fundamental
no modifica el tiempo de vida. Solo se observa
emisión de fluorescencia de las especies no
complejadas. AMORTIGUACION ESTATICA La
amortiguación dinámica es un proceso cinético que
actúa sobre el conjunto total de población de
moléculas excitadas lo que disminuye el tiempo
medio de decaimiento de dicha población.
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Luminiscencia y bioanálisis immunofluorescencia
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Luminiscencia y bioanálisis Immunofluorescencia.
Microscopía de immunofluorescencia, Citofluorimetr
ía de flujo, ensayos immunofluorimétricos
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Luminiscencia y bioanálisis Ensayos
immunofluorimétricos
7. Luminescència molecular
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Fluorescence Microscope
Graphical representation of what happens when a
fluorescing sample is observed with a
fluorescence microscope. Ultraviolet (UV) light
of a specific wavelength or set of wavelengths is
produced by passing light from a UV-emitting
source through the exciter filter. The filtered
UV light illuminates the specimen, in this case a
crystal of fluorspar, which emits fluorescent
light when illuminated with ultraviolet light.
Visible light emitted from the specimen, is then
filtered through a barrier filter that does not
allow reflected UV light to pass.
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(No Transcript)
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Confocal Fluorescence Microscope
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Confocal Fluorescence Microscope
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Organic Fluorophores
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Organic Fluorophores
Probe Ex (nm) Em (nm) MW Notes
Hydroxycoumarin 325 386 331 Succinimidyl ester
Aminocoumarin 350 445 330 Succinimidyl ester
Methoxycoumarin 360 410 317 Succinimidyl ester
Cascade Blue (375)401 423 596 Hydrazide
Pacific Blue 403 455 406 Maleimide
Pacific Orange 403 551
Lucifer yellow 425 528
NBD 466 539 294 NBD-X
R-Phycoerythrin (PE) 480565 578 240 k
PE-Cy5 conjugates 480565650 670 aka Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red
PE-Cy7 conjugates 480565743 767
Red 613 480565 613 PE-Texas Red
PerCP 490 675 Peridinin chlorphyll protein
TruRed 490,675 695 PerCP-Cy5.5 conjugate
FluorX 494 520 587 (GE Healthcare)
Fluorescein 495 519 389 FITC pH sensitive
BODIPY-FL 503 512
TRITC 547 572 444 TRITC
X-Rhodamine 570 576 548 XRITC
Lissamine Rhodamine B 570 590
Texas Red 589 615 625 Sulfonyl chloride
Allophycocyanin (APC) 650 660 104 k
APC-Cy7 conjugates 650755 767 PharRed
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Quantum dots
Special Class of Semiconductors Quantum dots,
also known as nanocrystals, are a special class
of materials known as semiconductors, which are
crystals composed of periodic groups of II-VI,
III-V, or IV-VI materials. II-VI ZnO, ZnS,
ZnSe, CdS, CdSe, CdTe III-V, GaN, GaP, GaAs, InP,
InAs IV-VI materials, Si, Ge Quantum dots are
unique class of semiconductor because they are so
small, ranging from 2-10 nanometers (10-50 atoms)
in diameter. At these small sizes materials
behave differently, giving quantum dots
unprecedented tunability and enabling never
before seen applications to science and
technology
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(No Transcript)
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Quantum dots vs Organic Fluorophores
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Quantum dots vs Organic Fluorophores
Quantum dots have significant advantages over
earlier technologies. Researchers can view
typically no more than three colours at once with
traditional fluorescence labelling, using
proteins, such as green fluorescent protein, or
organic dyes, such as rhodamine. Each of the
fluorophores must first be excited with a
specific wavelength of light, which can block the
emitted colour of other fluorophores in the
experiment. To overcome this problem, researchers
can mark multiple proteins in a cell with several
different colours, photograph them at different
times, and then superimpose the pictures.
Alternatively one protein can be tagged with one
fluorophore in one cell and another with a
different fluorophore in a similar cell.
. Generally for quantum dots, the colour is
very specific to the size and composition,
allowing the simultaneous fluorescence of many
different, specific colors and therefore allowing
the easy discrimination between tagged targets,
even in a single cell.
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Quantum dots vs Organic Fluorophores
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Quantum dots vs Organic Fluorophores
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Luminiscencia y bioanálisis PCR en tiempo real
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Luminiscencia y bioanálisis PCR en tiempo real
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Luminiscencia y bioanálisis PCR en tiempo real
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Luminiscencia y bioanálisis PCR en tiempo real
7. Luminescència molecular
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Luminiscencia y bioanálisis PCR en tiempo real
7. Luminescència molecular
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Luminiscencia y bioanálisis PCR en tiempo real
7. Luminescència molecular
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Luminiscencia y bioanálisis PCR en tiempo real
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LUMINISCENCIA MOLECULAR
Luminiscencia y bioanálisis PCR en tiempo real
7. Luminescència molecular