PRUEBAS BIOQUMICAS I METABOLISMO HIDROCARBONADO

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS IMETABOLISMO HIDROCARBONADO

• IES Miguel de Cervantes
• Laboratorio de Diagnóstico Clínico
• Fundamentos y Técnicas de Análisis
  Microbiológicos
• Profesor José Ángel Pina Alburquerque
• ?

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METABOLISMO

• Conjunto de reacciones químicas que tienen lugar
  en las células vivas ?

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METABOLISMO Clasificación

• FUENTE DE CARBONO
• Bacterias autótrofas
• Bacterias heterótrofas.
• FUENTE DE ENERGÍA
• Bacterias fototrofas
• Bacterias Quimiotrofas. ?

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(No Transcript)
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METABOLISMO

• CATABOLISMO
• Degradación Moléculas mayores a menores.
• Producción de energía (ATP).
• ANABOLISMO
• Síntesis de moléculas mayores a partir de otras
  menores (biosíntesis).
• Precisan aporte de energía (ATP).
• ANFIBOLISMO Metabolismo intermedio. ?

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(No Transcript)
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Ir a DP 14Ir a DP 21
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METABOLISMO

• RUTA BIOQUÍMICA Serie de reacciones químicas
  catalizadas enzimáticamente que tienen lugar en
  una célula. ?

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Recuerda

• CATALIZADOR Sustancia que puede acelerar una
  reacción química, sin sufrir ella misma
  modificaciones.
• ENZIMA Proteínas que actúan como catalizadores
  biológicos en los seres vivos. Cada enzima actúa
  específicamente sobre un sustrato que se
  transforma en el producto de la reacción. ?

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CATABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO

• Oxidación de azúcares para la obtención de la
  energía necesaria para la vida celular.
• La glucosa es el hidrato de carbono más
  utilizado.
• Dos mecanismos
• Respiración
• Fermentación ?

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CATABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO

• Glucólisis o ruta de Embdem-Meyerhof
• Ruta de las pentosas fosfato
• Ruta de Eutner-Doudorof
• Respiración aeróbica
• C.A.T. o Ciclo de Krebs
• Cadena de transporte de electrones
• Respiración anaeróbica
• Fermentación.
• Láctica
• Etanolica ?

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GLUCOLISIS

• Glucosa (6C) 2 Ac. Pirúvico (3C)
• Se reducen 2 NAD 2 NADH2
• Se producen 2 ATP
• ?

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GLUCOLISISGLU 2 PIR2 ADP 2
ATP2 NAD 2 NADH2(Volver a DP 28)
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RUTA DE LAS PENTOSAS FOSFATO

• Se pueden oxidar pentosas (procedentes de ácidos
  nucleicos, ATP, NAD, etc.) hasta fructosa-6-P y
  gliceraldehido-3-P que terminan de oxidarse en la
  glucólisis.
• Los intermediarios de esta vía se utilizan para
  síntesis de ácidos nucleicos, síntesis de glucosa
  en la fotosíntesis y algunos aminoácidos.
• Muchas bacterias oxidan la glucosa por esta vía
  además de por la glucólisis Por transformación
  previa de la glucosa en pentosas Vía del
  fosfogluconato. ?

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RUTA DE LAS PENTOSAS FOSFATO
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RUTA DEL FOSFOGLUCONATO
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RUTA DE ENTNER-DOUDOROF

• Es una vía alternativa a la glucólisis y
  pentosas-fosfato.
• Solo algunos microorganismos gram negativos la
  poseen
• Pseudomonas
• Rhizobium
• Agrobacterium ?

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C.A.T. y RESPIRACIÓN

• El Ac. Pirúvico (procedente de la glucosa) se
  termina de oxidar en el C.A.T. completamente
  hasta CO2 y H2O
• Se genera ATP por fosforilación oxidativa.
• Funciona una cadena transportadora de electrones
  desde los coenzimas reducidos (NADH, NADPH, FAD)
  hasta una molécula inorgánica que puede ser
• Respiración Aeróbica Aceptor terminal de
  electrones es el Oxígeno.
• Respiración Anaeróbica Aceptor terminal de
  electrones distinto del Oxígeno (NO3-, SO4,
  CO3).
• ?

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RESPIRACIÓN AERÓBICA

• Las dos moléculas de PIRÚVICO que provienen de
  una de glucosa entran en el Ciclo de Krebs donde
  se forman los nucleótidos reducidos.
• Los nucleótidos reducidos se oxidan de nuevo
  cediendo electrones a una CADENA DE TRANPORTE DE
  ELECTRONES (o respiratoria) donde se produce ATP.
  
• EL OXIGENO es el aceptor final de electrones en
  la cadena respiratoria. ?

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Ciclo de Krebs o C.A.T.

• Ac. Pirúvico Acetíl-CoA
• El Acetil-CoA entra en el C.A.T.
• En el CAT se forman los coenzimas o nucleótidos
  reducidos (NADH y FADH) que luego se oxidan en la
  cadena de transporte de electrones.
• Los tres átomos de carbono del pirúvico salen
  como CO2 ?

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• CICLO DE KREBS
• CO2
• CoEnz. Reducidos
• Productos intermedios
• ?

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• CICLO DE KREBS
• (observar C en marrón a CO2)
• Balance energético ?

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Cadena de transporte de electrones

• Procariotas En membrana plasmática.
• Eucariotas En membrana interna de las
  mitocondrias.
• Observ. Punto de acople del NADH y del FADH con
  producción de ATP

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Cadena de transporte de electrones

• Balance final desde glucosa hasta CO2, mediante
  glucolisis, CAT y Cadena Tr. e-
• C6H12O6 O2 38 ADP 38 P
• 6CO2 6 H2O 38 ATP
• Cada NADH produce 3 ATP.
• Cada FADH produce 2 ATP. ?

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Balance energético por cada molécula de glucosa

• Glucólisis
• Por fosforilación a nivel de sustrato 2 ATP
• 2 NADH 6 ATP
• Ciclo de Krebs
• 2 GTP ...........................................
  2 ATP
• De Pirúvico a Acetil-CoA 2 NADH 6 ATP
• En el Ciclo 6 NADH 18 ATP
• En el Ciclo 2 FADH 4 ATP
• TOTAL 38 ATP
• En Eucariotas son 36 pues los 2 NADH de la
  glucólisis pasan del citoplasma celular a la
  matriz mitocondrial como FADH. ?

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RESPIRACIÓN ANAERÓBICA

• Existe una cadena de transporte de electrones con
  un aceptor final distinto del O2
• El aceptor final de electrones puede ser
• NO3- NO2- o N2 (Pseudomonas y
  Bacillus)
• SO4 SH2 (Desulfovibrio)
• CO3 o CO2 CH4 (bacterias metanígenas)
• Se libera ATP de forma variable según el proceso.
  (Ej. para el NO3- , se forman 2 ATP por cada
  NADH (en vez de 3) por ser la cadena de
  transporte de e- más corta). ?

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FERMENTACIÓN

• Se inicia a partir del Ac. Pirúvico
• No requiere oxígeno, aunque puede a veces ocurrir
  en su presencia.
• No funciona el CAT ni Cadena de Tr. e-.
• El aceptor final de e- es una molécula orgánica.
• Libera energía a partir de azucares o de otras
  moléculas orgánicas (A.A., Ac. Orgánicos, bases
  nitrogenadas, etc.)
• Se producen solo 2 ATP por cada Glucosa. ?

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Fermentación láctica y etanólica
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FERMENTACIÓN
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FERMENTACIÓN
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(No Transcript)
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Pruebas Bioquímicas

• Investigan el metabolismo de un microorganismo
  previamente aislado.
• Sirven para identificar a los microorganismos.

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Relación de las bacterias con el oxígeno

• Se investiga el metabolismo de los hidratos de
  carbono en su relación con el oxígeno, según las
  rutas metabólicas que utilice metabolismo
  oxidativo o fermentativo.
• Una prueba sencilla Sembrando por picadura
  profunda en un tubo largo y estrecho con medio
  sólido sin aceptores terminales de electrones
  (oxígeno, nitratos, etc.) se obtiene
• Aerobia Crecimiento en la parte superior.
• Anaerobia Crecimiento en la parte inferior.
• Anaerobia facultativa Crecimiento en todo el
  tubo.

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Prueba de Hugh y Leiffson u Oxido-fermentativa
(O/F)

• Se usan dos tubos con un medio semisólido con un
  indicador de pH y un hidrato de carbono (se
  pueden investigar varios, aunque si no se
  especifica, se entiende que es glucosa).
• Uno de ellos se sella con vaselina o parafina
  estéril.
• Puede haber un tercer tubo control sin sembrar.
• Metabolismo oxidativo acidifica la superficie
  del medio
• Metabolismo fermentativo, acidifica todo el
  medio.
• Producción de gas (solo en fermentación) el
  medio aparece con burbujas, grietas o despegado
  del fondo.

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Prueba de Hugh y Leiffson u Oxido-fermentativa
(O/F)
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Prueba de Hugh y Leiffson u Oxido-fermentativa
(O/F)
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Prueba de Hugh y Leiffson u Oxido-fermentativa
(O/F)
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PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE ÁCIDO Y GAS

• Prueba de Screening (o de descarte) Primera
  orientación para posteriormente realizar otras
  pruebas más selectivas en caso de positividad.
• Estudia la capacidad degradativa de un
  microorganismo sobre un determinado hidrato de
  carbono.
• Se usa un medio líquido (agua de peptona) con un
  indicador de pH y campana de Durham.
• La producción de ácido se pone de manifiesto por
  el viraje de color del indicador de pH.
• La producción de gas se aprecia en la campana de
  Durham.
• La campana de Durham debe estar llena del medio
  de cultivo en el momento de sembrar.

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PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE ÁCIDO Y GAS
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Prueba de la ß-Galactosidasa (ONPG)

• Los microorganismos que fermentan la lactosa
  pueden poseer dos enzimas
• Lactosa permeasa Transporta lactosa a través de
  la membrana.
• ß-D-Galactosidasa Desdobla la lactosa en glucosa
  y galactosa.
• Los fermentadores activos de lactosa en 24 h
  (fermentadores rápidos) posen los dos enzimas.
• Los fermentadores tardíos de lactosa poseen solo
  ß-Galactosidasa, por lo que solo la fermentan en
  2 a15 días y en condiciones de alta concentración
  (la lactosa pasa a través de la membrana
  lentamente sin intervención de ningún enzima).

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Prueba de la ß-Galactosidasa (ONPG)

• Se utiliza para diferenciar enterobacterias
  (Proteus y Salmonella dan negativo esta prueba y
  E. coli positiva).
• La enzima ß-Galactosidasa se pone de manifiesto
  utilizando ONPG (orto-nitro-fenil-ß-D-galactopiran
  ósido)
• ONPG (incoloro) ß-Galactosidasa
  Ortonitrofenol (amarillo) Galactosa

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Prueba de la ß-Galactosidasa (ONPG)
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Prueba de la ß-Galactosidasa (ONPG)
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Prueba de la ß-Galactosidasa (ONPG)

• Se suele presentar en forma de tabletas o discos
  comerciales.
• Los microorganismos que se ensayan deben estar
  incubados en un medio con lactosa. Como el Agar
  Mc Conkey o el K.I.A.