INSTITUTO DE HEMATOLOGA E INMUNOLOGA ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL EN PACIENTES CON ANEMIA

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INSTITUTO DE HEMATOLOGÍA E INMUNOLOGÍAESTUDIO
DE LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL EN PACIENTES CON
ANEMIA DREPANOCÍTICA
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INTRODUCCIÓN Los trastornos de la hemoglobina
(Hb) constituyen el grupo de enfermedades
monogénicas más frecuentes en el mundo ocupando
la anemia drepanocítica (AD) un lugar cimero
entre las mismas. Hb S es el nombre de la
molécula de Hb anormal, siendo este defecto
molecular el primero en ser demostrado en
humanos. La secuenciación nucleotídica del
mARN de los genes de la globina ? s ha revelado
que el codón normal GAG en la posición ?6 ha sido
reemplazado por GUG. Este cambio determina la
inserción de valina en la posición del ácido
glutámico que se encuentra en la Hb A,
predominante en el adulto normal, lo que favorece
la polimerización de las moléculas de Hb S en
condiciones de baja presión parcial de oxígeno.
La gelificación distorsiona el glóbulo rojo y
disminuye su flexibilidad lo que puede provocar
fenómenos oclusivos vasculares.
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INTRODUCCIÓN (Continuación) Los pacientes con
AD tienen una gran variabilidad en el cuadro
clínico. Los individuos heterocigotos (Hb AS) son
comúnmente asintomáticos, en cambio, los
homocigotos (Hb SS) presentan diferentes
manifestaciones clínicas las cuales no se
expresan en el momento del nacimiento debido a
los niveles elevados de hemoglobina fetal (Hb F)
que interfiere en la polimerización de la Hb
S. Las manifestaciones clínicas más
frecuentes en los primeros años de vida son
- anemia - ictericia -
crisis mano - pie - crisis
vasooclusivas dolorosas abdominales y
ostiomioarticulares. - infecciones
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INTRODUCCIÓN (Continuación)Trastornos del
sistema inmune - Los neutrófilos presentan
alteraciones en la quimiotaxis, baja actividad
oxidativa, escaso poder bactericida y mayor
adhesividad al endotelio. - La fibrosis
esplénica, presente en la mayoría de estos
enfermos, compromete la síntesis de anticuerpos y
la función fagocítica. - Una actividad opsónica
disminuida, así como trastornos en la actividad
de la vía alternativa del complemento. -
Elevación de citocinas inflamatorias IL 6, IL 1,
TNF ?, formas solubles de las moléculas de
adhesión ICAM-1, VCAM-1, E-Selectina y
P-Selectina. - Un aumento de reactantes de fase
aguda, como la proteína C reactiva y el amiloide
A sérico, aún en enfermos en estado basal, lo que
indica un nivel de inflamación constante
subclínico.
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INTRODUCCIÓN (Continuación) - Se ha
referido tanto una disminución en los niveles
relativos de linfocitos T por deficiencias en
células CD4? , como aumentos de células T
citotóxicas. - Hipergammaglobulinemia, ya sea
a expensas de IgM o más frecuentemente de la
clase IgG siendo las subclases predominantes la
IgG1 e IgG3. - Se ha demostrado la síntesis de
autoanticuerpos contra antígenos de grupos
sanguíneos y contra los fosfolípidos de la
membrana celular de los hematíes falciformes,
entre los que se destacan anticuerpos
antifosfatidiletanolamina y antifosfatidilserina.
Considerando que la severidad clínica de la AD
al parecer está influenciada por múltiples
factores, se plantea la siguiente hipótesis de
trabajo
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• HIPÓTESIS DE TRABAJO
• Alteraciones de la respuesta inmune humoral
  pueden incidir en la expresión clínica y
  severidad de la enfermedad en pacientes con AD.
• OBJETIVO GENERAL
• Evaluar las posibles alteraciones de diversos
  parámetros de la respuesta inmune humoral en
  enfermos con AD en diferentes fases clínicas.
• OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• 1- Determinar la actividad de las vías clásica y
  alternativa del sistema complemento, así como la
  concentración de algunos de sus componentes en
  diferentes fases clínicas.
• 2- Determinar los niveles de inmunocomplejos
  circulantes en diferentes fases clínicas.
• 3- Evaluar los fenómenos de solubilización y de
  inhibición de la formación y precipitación de
  inmunocomplejos en diferentes fases clínicas.

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• OBJETIVOS ESPECÍFICOS (Continuación)
• 4- Realizar estudios seriados del complemento e
  inmunocomplejos circulantes y de la proteína C
  reactiva.
• 5- Evaluar la actividad funcional del factor D de
  la vía alternativa del complemento en enfermos en
  estado basal.
• 6- Determinar la actividad del sistema
  complemento en enfermos en estado basal con y sin
  historia previa de complicaciones clínicas. 7-
  Determinar los niveles de subclases de IgG en
  enfermos en estado basal, con y sin historia
  previa de complicaciones clínicas.8-
  Identificar la posible presencia de anticuerpos
  anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) en enfermos
  en estado basal y con crisis vasooclusiva
  dolorosa.

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UNIVERSO DE LA MUESTRA Se incluyeron enfermos
con el diagnóstico de AD atendidos en la consulta
de Hemoglobinopatías del Instituto de Hematología
e Inmunología - con 15 o más años de
edad, - en estado basal, sin manifestaciones
clínicas en los 3 meses previos al estudio,
- con crisis vasooclusivas dolorosas de
cualquier focalización, sin síntomas ni signos de
infección u otras complicaciones clínicas, -
con úlceras maleolares sin otras complicaciones
de la enfermedad, las infecciones demostradas
estaban limitadas a la zona de la úlcera, -
con crisis hepática cuyo diagnóstico se realizó
por el cuadro clínico y pruebas funcionales
hepáticas.
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UNIVERSO DE LA MUESTRA (Continuación)Ninguno de
los enfermos recibió transfusiones de glóbulos
rojos en los 3 meses anteriores al estudio y en
todos el HBsAg fue negativo. Los valores normales
en cada uno de los estudios realizados se
obtuvieron en 30 individuos sanos con
características de edad, sexo y raza similares a
los de la muestra problema.BIOÉTICA A todos
los pacientes se les explicó de forma
comprensible la naturaleza de su enfermedad, los
riesgos y beneficios de los procedimientos a
emplear, la confidencialidad de los resultados,
precisando el principio de voluntariedad. A
continuación se solicitó, mediante firma de
documento, su consentimiento de participación en
la investigación.ANÁLISIS ESTADÍSTICOSe empleó
el análisis de varianza no paramétrico de Kruskal
- Wallis, el coeficiente de correlación de rangos
de Spearman y la t de Student. Se consideró un
nivel de confianza del 95.
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ESTUDIOS REALIZADOS

• ? Activación del sistema complemento en
  diferentes fases clínicas.
• Se estudiaron 45 enfermos, se agruparon 23 en
  estado basal, 14 con crisis vasooclusivas
  dolorosas y 8 con crisis hepática. En todos los
  casos se midió la actividad hemolítica de la vía
  clásica del complemento (AHVC), la vía
  alternativa (AHVA), C3 y C4.
• ? Determinación de inmunocomplejos circulantes
  en diferentes fases clínicas.
• Se estudiaron 100 enfermos, agrupados en estado
  basal, 42 con crisis vasooclusivas dolorosas,
  28 con úlceras maleolares, 14 y con crisis
  hepática, 16. Los inmunocomplejos circulantes se
  determinaron mediante actividad
  anticomplementaria, precipitación con PEG 6000,
  inhibición de roseta EAC, título de
  inmunoconglutininas.

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ESTUDIOS REALIZADOS (Continuación)

• ? Estudio de la solubilización e inhibición de
  la formación y precipitación de inmunocomplejos.
• El estudio se realizó en 13 enfermos en crisis
  hepática y 26 en condiciones basales. La
  inhibición de la precipitación de inmunocomplejos
  se determinó haciendo reaccionar el 125 I - TT
  con una cantidad equivalente de anti TT en
  presencia de suero problema. La solubilización de
  inmunocomplejos se determinó añadiendo un
  complejo insoluble de 125 I - TT / anti TT al
  suero problema.
• ? Estudio seriado del complemento e
  inmunocomplejos circulantes.
• Se efectuó la medición seriada en 13 enfermos que
  cursaron cada uno por diferentes fases clínicas.
  De las 35 muestras de suero analizadas, 17
  correspondieron a condiciones basales, 8 a crisis
  vasooclusivas dolorosas y 10 a crisis hepáticas.
  En todas las muestras se midió AHVC, AHVA, factor
  B, C3, C4 e inmunocomplejos circulantes mediante
  la prueba de desviación del C1q (PDC1q) y PEG
  6000.

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ESTUDIOS REALIZADOS (Continuación)

• ? Estudio seriado de la proteína C reactiva.
• Se analizaron 42 muestras de sangre, obtenidas en
  diferentes momentos, de 16 enfermos en
  condiciones basales. La proteína C reactiva se
  detectó mediante un método de aglutinación con
  latex.
• ? Evaluación de la actividad funcional del factor
  D del sistema complemento.
• Se estudiaron 28 enfermos en estado basal. Se
  midió la AHVA, factor B y factor D.

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ESTUDIOS REALIZADOS (Continuación)

• ? Comparación de los niveles de complemento
  entre grupos de enfermos con AD en estado basal,
  con y sin historia de complicaciones clínicas
  previas al estudio.
• Se estudiaron 46 enfermos en estado basal. Se
  revisaron las historias clínicas y se analizó la
  enfermedad en el año previo al estudio, se
  clasificaron en dos grupos con y sin
  manifestaciones clínicas. Se determinó en ambos
  grupos la AHVC, AHVA, factor B, C3 y C4.
• ? Comparación de los niveles de subclases de IgG
  entre grupos de enfermos con AD en estado basal,
  con y sin historia de complicaciones clínicas
  previas al estudio.
• Se estudiaron 46 enfermos en estado basal. Se
  revisaron las historias clínicas y se analizó la
  enfermedad en el año previo al estudio, se
  clasificaron en dos grupos con y sin
  manifestaciones clínicas. Se determinaron los
  niveles de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

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ESTUDIOS REALIZADOS (Continuación)

• ? Determinación de ANCA en enfermos en diferentes
  fases clínicas.
• Se estudiaron 55 enfermos, 35 con crisis
  vasooclusiva dolorosa y 20 en estado basal. Los
  niveles de cANCA y pANCA fueron determinados
  mediante juegos comerciales anti MPO Elisa y anti
  PR3 Elisa. Se incluyeron como controles, además
  de los 30 sujetos sanos, 50 enfermos con
  glomerulonefritis, 45 con nefroangioesclerosis y
  25 con diversas formas de vasculitis no
  precisadas.

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RESULTADOS
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Tabla 1. Niveles de complemento en enfermos con
anemia drepanocítica en diferentes fases
clínicas.
Leyenda - (?) p lt 0.05 (? ? ) p lt
0.005 (? ? ?) p lt 0.001
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Tabla 2 Inmunocomplejos circulantes y niveles
de complemento en enfermos con anemia
drepanocítica en diferentes fases clínicas.
Leyenda - Iks inmunoconglutininas
M mediana (?) plt
0.05 (? ?) plt 0.001
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Tabla 3. Solubilización e inhibición de la
formación y precipitación de inmunocomplejos, así
como niveles de complemento e inmunocomplejos
circulantes en enfermos con anemia drepanocítica
con crisis hepática.  
Leyenda
IPIC inhibición de la formación y precipitación
de inmunocomplejos
SIC solubilización de inmunocomplejos
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Estudio seriado de la proteína C reactiva

• Se demostró la proteína C reactiva positiva en 23
  muestras de sangre, extraidas en diferentes
  momentos, de 12 de los 16 enfermos en estado
  basal estudiados.

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Tabla 4 Evaluación de la actividad funcional
del factor D de lavía alternativa en pacientes
con anemia drepanocítica en estadobasal.

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Tabla 5- Comparación de los niveles de
complemento entre los grupos de enfermos con
anemia drepanocítica en estado basal con y sin
complicaciones clínicas previas y con los
controles normales.
AHVC (CH50) 25.8 3.0
26.4 2.8 27.0 2.7  
AHVA () 78.1 10.2 (?) 97.1
14.8 98.0 16.0   AHFB ()
75.0 11.3 (?) 98.6 17.4
100.0 24.0   C3 (g / l )
0.90 0.37 (?) 1.53 0.44
1.52 0.50   C4 (g / l ) 0.32
0.10 0.33 0.11
0.35 0.15

Enfermos
Controles Determinación Con
complicaciones Sin complicaciones
normales
(n 25) (n 21)
(n 30)
Leyenda (?) diferencia significativa con
respecto al grupo de pacientes sin
complicaciones y controles
normales para una p ? 0.001.
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Tabla 6- Comparación de los niveles de las
subclases de IgG entre los grupos de enfermos
con anemia drepanocítica en estado basal con y
sin complicaciones clínicas previas y con los
controles normales.

Enfermos
Controles Determinación
Con complicaciones Sin complicaciones
normales
(n 25) (n 21)
(n 20)  
IgG1 11.56 ?
1.32 (?) 8.98 ? 1.12
8.32 ? 1.25   IgG2
6.18 ? 0.73 (?) 4.59 ? 0.96
4.78 ? 0.93   IgG3
0.56 ? 0.17 0.55 ?
0.15 0.49 ? 0.10   IgG4
1.05 ? 0.27
0.95 ? 0.17 0.99 ? 0.14
Leyenda - (?) diferencia significativa con
respecto a los controles normales y al grupo de
pacientes sin complicaciones para una plt 0.001.
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Tabla 7 Anticuerpos anticitoplasma de
neutrófilos (ANCA) en enfermos con anemia
drepanocítica .
Leyenda - MPO mieloperoxidasa PR3
proteinasa 3 (?) p ? 0.001
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IL-6
LIBERACIÓN DE GLUCOCORTICOIDES
OCLUSIÓN
eosinofilia mastocitosis ? I gE
Figura 1 Esquema integrador de las
alteraciones de la respuesta inmune que se
observan en pacientes con anemia drepanocítica.
Nota IPIC -
Inhibición de la precipitación de
inmunocomplejos SIC - Solubilización de
inmunocomplejos línea discontinua- -
-Inhibición.