Title: S. Misirlic Dencic, Z. Markovic, B. Todorovic-Markovic, D. Kepic, K. Arsikin,
1S. Misirlic Dencic, Z. Markovic, B.
Todorovic-Markovic, D. Kepic, K. Arsikin, Ž.
Stanojevic, N. Zogovic, M. Dramicanin, V.
Trajkovic
Fototermalna antitumorska aktivnost grafenskih
nanocestica i ugljenicnih nanotuba pobudenih
zracenjem bliske IC oblasti
2Uvod
- U okolnostima nemogucnosti primene hirurške
terapije, selektivna ablacija malignog tkiva
toplotom je efikasna alternativna terapijska
metoda. - Nažalost, glavne termicke ablativne tehnike
(laser, ultrazvuk, mikro-talasi i radio-talasi)
ne poseduju same po sebi selektivnost prema
malignim celijama.
3Uvod
- U skladu sa tim, neophodno je povecati
osetljivost malignih celija na iradijaciju u
cilju povecanja efikasnosti i smanjenja
toksicnosti pri primeni termalne ablacije
tumorskog tkiva. - Jedna od mogucih, obecavajucih strategija
fototermalne terapije maligniteta je upotreba
nanocestica u cilju efikasne konverzije energije
zracenja bliske IC oblasti u vibracionu energiju
i sledstvenu toplotu koja ubija maligne celije.
4Uvod
- Upotreba zracenja bliske IC oblasti u opsegu
700-1000 nm za indukciju hipertermije je posebno
interesantna, obzirom da biološki sistemi
uglavnom nemaju hromofore koje mogu apsorbovati
zracenja ovih talasnih dužina.
5Uvod
- Ugljenicne nanotube (CNT) su cilindricne
strukture do nekoliko stotina nanometara u
dijametru, dužine nekoliko mikrometara, koje se
sastoje od atomski-tankih listica ugljenika koji
su zovu grafen. - Poslednjih par godina proucavanje osobenosti
grafena ukazuje na svojstva koja prete da ugroze
dominaciju CNT u nanotehnologijama, i otvaraju
mogucnost primene grafena u biomedicini.
6Uvod
- Ipak, za razliku od potvrdenog fototermalnog
antitumorskog delovanja CNT, efekti grafenskih
nanocestica na celije tumora do danas nisu
razjašnjeni. - Samo jedna skorašnja studija (Nano Lett
2010103318) na mišjem modelu je pokazala da
intravenski aplikovane grafenske nanocestice
smanjuju velicinu tumora nakon hipertermije
izazvane zracenjem bliske IC oblasti.
7Uvod
- Ipak, dva vrlo važna pitanja ostala su do danas
bez odgovora
8Cilj istraživanja
- U ovom istraživanju poredeno je fototermalno
antitumorsko dejstvo grafenskih nanocestica i
ugljenicnih nanotuba pobudenih kontinualnim IC
laserom talasne dužine 808 nm (2 W/cm2, model
RLTMDL-808-1 Wproizvodaca Roithner
LaserTechnik), u trajanju od 30-300s.
9Materijal i metode
- U eksperimentima su korišcene stabilne vodene
suspenzije sledecih nanocestica - Polivinil-pirolidin grafenskih nanocestica (GPVP)
- Ugljenicnih nanotuba funkcionalizovanih sa DNK-
(CNTDNA) - Ugljenicnih nanotuba funkcionalizovanih sa
natrijum dodecilbenzensulfonatom (CNTSDBS)
10Materijal i metode
- Atomic force microscopy (AFM) merenja su
izvršena na AFM mikroskopu (Quesant Instrument
Corp. Agoura Hills, CA). - UV-vis spektralna analiza nanougljenicnih
suspenzija je vršena u opsegu talasnih dužina
500-1100 nm pomocu Avantes UV-vis
spektrofotometra na 20C uz automatsku korekciju
za rastvarac (voda).
11Materijal i metode
- Iluminacija je vršena kontinualnim IC laserom
talasne dužine 808 nm (2 W/cm2, model
RLTMDL-808-1 Wproizvodaca Roithner
LaserTechnik), u trajanju od 30-300 s. - Porast temperature je registrovan termoparom
uronjenim u suspenziju tako da nije bio direktno
izložen laserskoj svetlosti. - Analiza antitumorskog delovanja nanocestica je
izvršena na celijskoj liniji humanog glioma
(U251).
12Materijal i metode
- Za procenu vijabiliteta korišceno je bojenje
kristal violetom (CV) i MTT. - Analiza molekarnog mehanizma antitumorskog
delovanja nanocestica (apoptoza/nekroza,
oksidativni stres i depolarizacija mitohondrija)
vršena je primenom protocne citometrije.
13Rezultati
- Karakterizacija ugljenicnih nanomaterijala
14Karakterizacija grafenskih nanocestica
Surface profile
15Karakterizacija grafenskih nanocestica
- Analiza dobijenih slika minimalno 200 grafenskih
nanocestica je ukazala da se u suspenziji GPVP
nalaze kao - single layer cestice dijametra do 50 nm
- bilayer cestice dijametra 50-70 nm
- multilayer cestice dijametra 70-360 nm
- Dominirale su bilayer cestice dijametra oko 70
nm debljine 2 nm.
16Karakterizacija ugljenicnih nanotuba
Small scale AFM images
Large scale AFM images
CNTSDBS
Surface profile
17Karakterizacija ugljenicnih nanotuba
- Vecina nanotuba CNTSDBS je u suspenziji formirala
snopove prosecne dužine 1.6 µm, dijametra oko 60
nm i visine 3 nm. - Morfologija CNTDNA je bila slicna.
18Karakterizacija ugljenicnih nanomaterijala
- Na osnovu koncentracije nanomaterijala u vodenoj
suspenziji i njihove mase izracunata je
koncentracija nanomaterijala. - Ona je iznosila oko 1015 grafenskih nanocestica/l
u suspenziji koncentracije 20 µg/ml i oko 2 x
1012 CNTSDBS/l u suspenziji iste koncentracije.
19Rezultati
- Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
20UV-vis analiza absorpcije zracenja bliske IC
oblasti od strane ugljenicnih nanomaterijala
- CNT više apsorbuju svetlost bliske IC oblasti u
odnosu na GPVP. - Kontrolni rastvori PVP, DNA i SDBS nisu
apsorbovali zracenje bliske IC oblasti.
21Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
22Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
- Suspenzije svih ispitivanih nanomaterijala su
pokazale porast temperature nakon ekspozicije
zracenju bliske IC oblasti koje je bilo zavisno
od njihove koncentracije kao i od dužine trajanja
ekspozicije. - Grafenske nanocestice su pod istim uslovima
generisale veci porast temperature u poredenju sa
CNT!!!
23GPVP
CNTDNA
?TCNT 18C
?TG 35C
65
48
?TG/ ?TCNT 2
24GPVP
CNTSDBS
?TCNT 19C
?TG 35C
65
49
?TG/ ?TCNT 2
25Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
- Sa druge strane, kapacitet povecanja temperature
nakon apsorpcije zracenja bliske IC oblasti je
bio skoro identican za oba tipa CNT. - Iz ovoga se može zakljuciti da nacin preparacije
ovih nano suspenzija ne utice na njihovu
fototermalnu senzitivnost. - Veca fototermalna efikasnost grafenskih nano
cestica verovatno se može objasniti njihovom
boljom disperznošcu
26Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
- Uzimajuci u obzir termodinamicka, opticka i
geometrijska svojstva ugljenicnih nano
materijala, upotrebili smo sledece jednacine
- ?Q toplota
- m masa nanocestice
- c toplotni kapacitet
- ?T porast temperature
- N broj cestica u suspenziji
- m1 masa reprezantativnog grafenskog bilayer-a
tj. ugljenicnog snopa nano tuba - A apsorpcija zracenja (808 nm)
- S površina nano materijala koja apsorbuje
zracenje - Ef efikasnost apsorpcije (2.3 za layer
grafena tj. 20 za snop CNT)
(1)
(2)
27Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
- Aproksimovali smo da je razvijena toplota nakon
zracenja nanocestica i CNT bliskom IC oblsti
istog reda velicine. - Na osnovu jednacina (1) i (2) izvedena je
jednacina za odnos relativnog porasta temperature
za grafenske nanocestice i CNT
dCNT prosecan dijametar snopa CNT hG visina
grafenske nanocestice
28Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
- Izracunata vrednost odnosa ?TG/ ?TCNT je 3.5 i
slicna je eksperimentalno dobijenoj vrednosti
2. - Dakle, iako CNT imaju bolju fototermalnu
senzitivnost, generišu manju kolicinu toplote u
odnosu na grafenske nanocestice. - CNT, dakle, imaju tendenciju da agregiraju i
formiraju snopove usled cega su u rastvoru manje
dispergovane od grafena.
29Rezultati
- Fototermalna antitumorska efikasnost grafena i CNT
30Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT
na U251 celije
Dozno i vremenski zavisna citotoksicnost prema
U251 celijama glioma
31Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT
na U251 celije
GPVP
CNTDNA
U skladu sa izmerenim skokom temperature nakon
primene zracenja bliske IC oblasti, grafenske
nanocestice su pokazale nekoliko puta bolju
efikasnost u ubijanju tumorskih celija u odnosu
na CNT !!!
32Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT
na U251 celije
33Rezultati
- Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog
fototermalnog antitumorskog delovanja
34Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog
fototermalnog antitumorskog delovanja
- Nekroza i apoptoza su dva glavna modaliteta
celijske smrti koja se u potpunosti razlikuju po
mehanizmu nastanka i morfološkim promenama koje
ih prate. - Nekrozu karakteriše gubitak integriteta celijske
membrane, stimulacija imunološkog odgovora i
oštecenje okolnih zdravih celija. - Apoptozu karakteriše fragmentacija nuklearne DNK
u odsustvu oštecenja membrane, koja eksponira
fosfatidilserin.
35Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog
fototermalnog antitumorskog delovanja
U251 su bile izložene zracenju 3 min u
prisustvu/odsustvu GPVP (10µg/ml)
36Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog
fototermalnog antitumorskog delovanja
- Test aktivnosti LDH je ukazao na porast
permeabiliteta celijske mebrane u 50 celija
(49.2 17.3 n2) - Može se zakljuciti da nekroza nije jednini
mehanizam fototermalnog antitumorskog delovanja
grafena.
37FACS analize (morfologija celija)
24h
APOPTOZA
Smanjenje velicine celija
Porast granuliranosti celija
38FACS PI (fragmentacija DNK)
24h
39FACS Ann/PI (eksternalizacija fosfatidilserina)
24h
NEKROTICNE
KASNA APOPTOZA
Ann/PI
Ann/PI
Ann-/PI
Ann-/PI
Ukupan broj Ann celija u kontroli 9.4 a u
tretmanu 95.5
Ann/PI-
Ann/PI-
Ann-/PI-
Ann-/PI-
ZDRAVE
RANA APOPTOZA
40FACS ApoStat (aktivacija kaspaza)
24h
plt 0.05 ANOVA
U251 su bile izložene zracenju 3 min u
prisustvu/odsustvu GPVP (10µg/ml)
41FACS DePsi (depolarizacija mitohondrija)
4h
plt 0.05 ANOVA
Gubitak mmp (D?)
42FACS DHR (produkcija ROS)
4h
plt 0.05 ANOVA
43FACS DHE (produkcija superoksida)
4h
plt 0.05 ANOVA
44Zakljucci
- Grafenske nanocestice pokazuju fototermalno
antitumorsko dejstvo nakon pobudivanja zracenjem
bliske IC oblasti. - Bolja disperznost i manja velicina grafenskih
nanocestica je odgovorna za superioran
fototermalni antitumorski efekat u odnosu na CNT - Mehanizam antitumorskog delovanja je kombinacija
apoptoze i nekroze usled indukcije oksidativnog
stresa i oštecenja mitohondrija.
45Zakljucci
- S obzirom na veliku površinu, malu toksicnost
i jeftinu proizvodnju, grafenske nanocestice mogu
biti potencijalni kandidati za fototermalnu
terapiju maligniteta.
46REALIZATORI ISTRAŽIVANJA
Katarina Arsikin Aleksandar Pantovic
Rukovodilac Vladimir Trajkovic