S. Misirlic Dencic, Z. Markovic, B. Todorovic-Markovic, D. Kepic, K. Arsikin, - PowerPoint PPT Presentation

Title: S. Misirlic Dencic, Z. Markovic, B. Todorovic-Markovic, D. Kepic, K. Arsikin,


1
S. Misirlic Dencic, Z. Markovic, B.
Todorovic-Markovic, D. Kepic, K. Arsikin, Ž.
Stanojevic, N. Zogovic, M. Dramicanin, V.
Trajkovic
Fototermalna antitumorska aktivnost grafenskih
nanocestica i ugljenicnih nanotuba pobudenih
zracenjem bliske IC oblasti
2
Uvod

• U okolnostima nemogucnosti primene hirurške
  terapije, selektivna ablacija malignog tkiva
  toplotom je efikasna alternativna terapijska
  metoda.
• Nažalost, glavne termicke ablativne tehnike
  (laser, ultrazvuk, mikro-talasi i radio-talasi)
  ne poseduju same po sebi selektivnost prema
  malignim celijama.

3
Uvod

• U skladu sa tim, neophodno je povecati
  osetljivost malignih celija na iradijaciju u
  cilju povecanja efikasnosti i smanjenja
  toksicnosti pri primeni termalne ablacije
  tumorskog tkiva.
• Jedna od mogucih, obecavajucih strategija
  fototermalne terapije maligniteta je upotreba
  nanocestica u cilju efikasne konverzije energije
  zracenja bliske IC oblasti u vibracionu energiju
  i sledstvenu toplotu koja ubija maligne celije.

4
Uvod

• Upotreba zracenja bliske IC oblasti u opsegu
  700-1000 nm za indukciju hipertermije je posebno
  interesantna, obzirom da biološki sistemi
  uglavnom nemaju hromofore koje mogu apsorbovati
  zracenja ovih talasnih dužina.

5
Uvod

• Ugljenicne nanotube (CNT) su cilindricne
  strukture do nekoliko stotina nanometara u
  dijametru, dužine nekoliko mikrometara, koje se
  sastoje od atomski-tankih listica ugljenika koji
  su zovu grafen.
• Poslednjih par godina proucavanje osobenosti
  grafena ukazuje na svojstva koja prete da ugroze
  dominaciju CNT u nanotehnologijama, i otvaraju
  mogucnost primene grafena u biomedicini.

6
Uvod

• Ipak, za razliku od potvrdenog fototermalnog
  antitumorskog delovanja CNT, efekti grafenskih
  nanocestica na celije tumora do danas nisu
  razjašnjeni.
• Samo jedna skorašnja studija (Nano Lett
  2010103318) na mišjem modelu je pokazala da
  intravenski aplikovane grafenske nanocestice
  smanjuju velicinu tumora nakon hipertermije
  izazvane zracenjem bliske IC oblasti.

7
Uvod

• Ipak, dva vrlo važna pitanja ostala su do danas
  bez odgovora

8
Cilj istraživanja

• U ovom istraživanju poredeno je fototermalno
  antitumorsko dejstvo grafenskih nanocestica i
  ugljenicnih nanotuba pobudenih kontinualnim IC
  laserom talasne dužine 808 nm (2 W/cm2, model
  RLTMDL-808-1 Wproizvodaca Roithner
  LaserTechnik), u trajanju od 30-300s.

9
Materijal i metode

• U eksperimentima su korišcene stabilne vodene
  suspenzije sledecih nanocestica
• Polivinil-pirolidin grafenskih nanocestica (GPVP)
  
• Ugljenicnih nanotuba funkcionalizovanih sa DNK-
  (CNTDNA)
• Ugljenicnih nanotuba funkcionalizovanih sa
  natrijum dodecilbenzensulfonatom (CNTSDBS)

10
Materijal i metode

• Atomic force microscopy (AFM) merenja su
  izvršena na AFM mikroskopu (Quesant Instrument
  Corp. Agoura Hills, CA).
• UV-vis spektralna analiza nanougljenicnih
  suspenzija je vršena u opsegu talasnih dužina
  500-1100 nm pomocu Avantes UV-vis
  spektrofotometra na 20C uz automatsku korekciju
  za rastvarac (voda).

11
Materijal i metode

• Iluminacija je vršena kontinualnim IC laserom
  talasne dužine 808 nm (2 W/cm2, model
  RLTMDL-808-1 Wproizvodaca Roithner
  LaserTechnik), u trajanju od 30-300 s.
• Porast temperature je registrovan termoparom
  uronjenim u suspenziju tako da nije bio direktno
  izložen laserskoj svetlosti.
• Analiza antitumorskog delovanja nanocestica je
  izvršena na celijskoj liniji humanog glioma
  (U251).

12
Materijal i metode

• Za procenu vijabiliteta korišceno je bojenje
  kristal violetom (CV) i MTT.
• Analiza molekarnog mehanizma antitumorskog
  delovanja nanocestica (apoptoza/nekroza,
  oksidativni stres i depolarizacija mitohondrija)
  vršena je primenom protocne citometrije.

13
Rezultati

• Karakterizacija ugljenicnih nanomaterijala

14
Karakterizacija grafenskih nanocestica

• Large scale AFM images

• Small scale AFM images

Surface profile
15
Karakterizacija grafenskih nanocestica

• Analiza dobijenih slika minimalno 200 grafenskih
  nanocestica je ukazala da se u suspenziji GPVP
  nalaze kao
• single layer cestice dijametra do 50 nm
• bilayer cestice dijametra 50-70 nm
• multilayer cestice dijametra 70-360 nm
• Dominirale su bilayer cestice dijametra oko 70
  nm debljine 2 nm.

16
Karakterizacija ugljenicnih nanotuba
Small scale AFM images
Large scale AFM images
CNTSDBS
Surface profile
17
Karakterizacija ugljenicnih nanotuba

• Vecina nanotuba CNTSDBS je u suspenziji formirala
  snopove prosecne dužine 1.6 µm, dijametra oko 60
  nm i visine 3 nm.
• Morfologija CNTDNA je bila slicna.

18
Karakterizacija ugljenicnih nanomaterijala

• Na osnovu koncentracije nanomaterijala u vodenoj
  suspenziji i njihove mase izracunata je
  koncentracija nanomaterijala.
• Ona je iznosila oko 1015 grafenskih nanocestica/l
  u suspenziji koncentracije 20 µg/ml i oko 2 x
  1012 CNTSDBS/l u suspenziji iste koncentracije.

19
Rezultati

• Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

20
UV-vis analiza absorpcije zracenja bliske IC
oblasti od strane ugljenicnih nanomaterijala

• CNT više apsorbuju svetlost bliske IC oblasti u
  odnosu na GPVP.
• Kontrolni rastvori PVP, DNA i SDBS nisu
  apsorbovali zracenje bliske IC oblasti.

21
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
22

Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

• Suspenzije svih ispitivanih nanomaterijala su
  pokazale porast temperature nakon ekspozicije
  zracenju bliske IC oblasti koje je bilo zavisno
  od njihove koncentracije kao i od dužine trajanja
  ekspozicije.
• Grafenske nanocestice su pod istim uslovima
  generisale veci porast temperature u poredenju sa
  CNT!!!

23
GPVP
CNTDNA
?TCNT 18C
?TG 35C
65
48
?TG/ ?TCNT 2
24
GPVP
CNTSDBS
?TCNT 19C
?TG 35C
65
49
?TG/ ?TCNT 2
25
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

• Sa druge strane, kapacitet povecanja temperature
  nakon apsorpcije zracenja bliske IC oblasti je
  bio skoro identican za oba tipa CNT.
• Iz ovoga se može zakljuciti da nacin preparacije
  ovih nano suspenzija ne utice na njihovu
  fototermalnu senzitivnost.
• Veca fototermalna efikasnost grafenskih nano
  cestica verovatno se može objasniti njihovom
  boljom disperznošcu

26
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

• Uzimajuci u obzir termodinamicka, opticka i
  geometrijska svojstva ugljenicnih nano
  materijala, upotrebili smo sledece jednacine

• ?Q toplota
• m masa nanocestice
• c toplotni kapacitet
• ?T porast temperature
• N broj cestica u suspenziji
• m1 masa reprezantativnog grafenskog bilayer-a
  tj. ugljenicnog snopa nano tuba
• A apsorpcija zracenja (808 nm)
• S površina nano materijala koja apsorbuje
  zracenje
• Ef efikasnost apsorpcije (2.3 za layer
  grafena tj. 20 za snop CNT)

(1)
(2)
27
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

• Aproksimovali smo da je razvijena toplota nakon
  zracenja nanocestica i CNT bliskom IC oblsti
  istog reda velicine.
• Na osnovu jednacina (1) i (2) izvedena je
  jednacina za odnos relativnog porasta temperature
  za grafenske nanocestice i CNT

dCNT prosecan dijametar snopa CNT hG visina
grafenske nanocestice
28
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT

• Izracunata vrednost odnosa ?TG/ ?TCNT je 3.5 i
  slicna je eksperimentalno dobijenoj vrednosti
  2.
• Dakle, iako CNT imaju bolju fototermalnu
  senzitivnost, generišu manju kolicinu toplote u
  odnosu na grafenske nanocestice.
• CNT, dakle, imaju tendenciju da agregiraju i
  formiraju snopove usled cega su u rastvoru manje
  dispergovane od grafena.

29
Rezultati

• Fototermalna antitumorska efikasnost grafena i CNT

30
Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT
na U251 celije
Dozno i vremenski zavisna citotoksicnost prema
U251 celijama glioma
31
Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT
na U251 celije
GPVP
CNTDNA
U skladu sa izmerenim skokom temperature nakon
primene zracenja bliske IC oblasti, grafenske
nanocestice su pokazale nekoliko puta bolju
efikasnost u ubijanju tumorskih celija u odnosu
na CNT !!!
32
Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT
na U251 celije
33
Rezultati

• Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog
  fototermalnog antitumorskog delovanja

34
Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog
fototermalnog antitumorskog delovanja

• Nekroza i apoptoza su dva glavna modaliteta
  celijske smrti koja se u potpunosti razlikuju po
  mehanizmu nastanka i morfološkim promenama koje
  ih prate.
• Nekrozu karakteriše gubitak integriteta celijske
  membrane, stimulacija imunološkog odgovora i
  oštecenje okolnih zdravih celija.
• Apoptozu karakteriše fragmentacija nuklearne DNK
  u odsustvu oštecenja membrane, koja eksponira
  fosfatidilserin.

35
Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog
fototermalnog antitumorskog delovanja
U251 su bile izložene zracenju 3 min u
prisustvu/odsustvu GPVP (10µg/ml)
36
Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog
fototermalnog antitumorskog delovanja

• Test aktivnosti LDH je ukazao na porast
  permeabiliteta celijske mebrane u 50 celija
  (49.2 17.3 n2)
• Može se zakljuciti da nekroza nije jednini
  mehanizam fototermalnog antitumorskog delovanja
  grafena.

37
FACS analize (morfologija celija)
24h
APOPTOZA
Smanjenje velicine celija
Porast granuliranosti celija
38
FACS PI (fragmentacija DNK)
24h
39
FACS Ann/PI (eksternalizacija fosfatidilserina)
24h
NEKROTICNE
KASNA APOPTOZA
Ann/PI
Ann/PI
Ann-/PI
Ann-/PI
Ukupan broj Ann celija u kontroli 9.4 a u
tretmanu 95.5
Ann/PI-
Ann/PI-
Ann-/PI-
Ann-/PI-
ZDRAVE
RANA APOPTOZA
40
FACS ApoStat (aktivacija kaspaza)
24h
plt 0.05 ANOVA
U251 su bile izložene zracenju 3 min u
prisustvu/odsustvu GPVP (10µg/ml)
41
FACS DePsi (depolarizacija mitohondrija)
4h
plt 0.05 ANOVA
Gubitak mmp (D?)
42
FACS DHR (produkcija ROS)
4h
plt 0.05 ANOVA
43
FACS DHE (produkcija superoksida)
4h
plt 0.05 ANOVA
44
Zakljucci

1. Grafenske nanocestice pokazuju fototermalno
   antitumorsko dejstvo nakon pobudivanja zracenjem
   bliske IC oblasti.
2. Bolja disperznost i manja velicina grafenskih
   nanocestica je odgovorna za superioran
   fototermalni antitumorski efekat u odnosu na CNT
3. Mehanizam antitumorskog delovanja je kombinacija
   apoptoze i nekroze usled indukcije oksidativnog
   stresa i oštecenja mitohondrija.

45
Zakljucci

• S obzirom na veliku površinu, malu toksicnost
  i jeftinu proizvodnju, grafenske nanocestice mogu
  biti potencijalni kandidati za fototermalnu
  terapiju maligniteta.

46
REALIZATORI ISTRAŽIVANJA
Katarina Arsikin Aleksandar Pantovic
Rukovodilac Vladimir Trajkovic