TECHNIQUES SPECIALES

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TECHNIQUES SPECIALES

• CULTURES CELLULAIRES
• CRIODECAPAGE
• CENTRIFUGATION (FRACTIONATION
• CELLULAIRE)
• TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES
• TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES
• DIFFRACTOMÉTRIE DE RAYONS X

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CULTURES CELLULAIRES

• Definition
• La culture cellulaire désigne un ensemble de
  techniques utilisées pour faire croître des
  cellules hors de leur organisme ("ex-vivo") ou de
  leur milieu d'origine, dans un but
  d'expérimentation scientifique ou de fécondation
  in vitro
• Les cellules mises en culture peuvent être
• 1) des micro-organismes libres (bactéries ou
  levures ex. collectés avec une boulette de coton
  les dépôts crémeuse des candida albicans et
  effectuer une culture cellulaire résultats
  positive - plus de dix colonies mycélium )
• 2) des cellules "saines" prélevées fraîchement
  d'un organisme (biopsie,...), on parle alors de
  "culture primaire". Ces cellules ne peuvent
  habituellement pas être maintenues en culture
  indéfiniment, notamment à cause de leur nombre
  limité de divisions.
• 3) des cellules ayant une capacité de division
  non limitée (on parle d'"immortalité en
  culture").
• 4) des lignées cellulaires. Les lignées sont soit
  des cellules cancéreuses, soit des cellules en
  voie de cancérisation, soit des cellules saines
  rendues "immortelles" artificiellement.
• 5) des tranches d'organes (d'épaisseur optimisée
  selon le tissu)

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Conditions de travaille

• optimisation des conditions "atmosphériques"
  (ajout d'oxygène...)
• optimisation de la composition des milieux
  nutritifs (ajout de certaines hormones,...)
• optimisation des supports (composition en
  biomolécules,...)
• culture sous agitation
• co-culture avec des cellules "nourricières"
• culture sur des tissus préalablement "tués" par
  un procédé de congélation/décongélation
• inclusion dans des gouttelettes d'alginate

Installation des instruments stériles
Transfert dans un nouveau milieu pour
fragmentation de l'embryon  
Introduction dans le flacon de culture d'une
suspension de cellules d'embryons à l'aide d'une
pipette stérile
Mise à l'étuve des flacons pendant 24 heures à
37C

• Aplication pratiques
• Letude des caracteres morphologiques et
  biologiques
• Letude des biologie tissulaire
• Letude in vivo des cellule
• les effects des hormones ou des facteurs de
  croissance
• interaction entre different types des cellule

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LA TECHNIQUE DE CRYODÉCAPAGE

• Definition
• La technique de cryodécapage consiste en cassant
  à part (fracturant) un échantillon biologique
  congelé le détail structurel exposé par le plan
  de la fracture est alors envisagé par la
  déposition en vide de platine carbone pour faire
  un réplica (copie exacte) pour l'examen dans le
  microscope électronique de transmission (obtenir
  une image miroir de la surface fracturée).
• Étapes
• la congélation rapide
• la fracture
• produire le réplica
• le nettoyage de la réplique

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LA TECHNIQUE DE CRYODÉCAPAGE

• Le protocole de travail
• La congélation rapide
• - dans les protocoles de routine, une étape de
  prétraitement est exécuté avant congeler,
  comprenant typiquement la fixation dans
  glutaraldehyde suivi par la cryoprotection avec
  glycérol.
• - pour congeler le tissu on doit plonger
  rapidement un échantillon convenablement monté
  dans un agent de refroidissement liquide (par
  ex., azote liquide sousrafraîchi).
• -pour éviter la formation des cristaux de glace,
  on appelle a létape de prétraitement le
  cryoprotectant le plus utilisé est le glycérol
  comme l'exposition au glycérol (ou d'autre
  cryoprotectants) peut causer des défets dans la
  structure de la membrane cellulaire, la pratique
  standard doit réaliser la fixation chimique avec
  glutaraldehyde d'abord.
• La fracture
• - la fracture de l'exemplaire congelé est
  d'habitude réalisé sous le vide en utilisant une
  lame de microtome rafraîchie de d'azote liquide
  ou en cassant l'exemplaire congelé à part dans un
  dispositif articulé la fracture se fait avec une
  lame de rasoir sous l'azote liquide à la pression
  atmosphérique la fracture par la lame de
  microtome rafraîchie suppose le placement de
  léchantillon sur un support rafraîchi.
• 3. Le nettoyage de la réplique
• - après réaliser la réplique, l'échantillon est
  apporté à la pression atmosphérique et à la
  température environnementale la matière
  biologique est enlevée de la réplique en
  utilisant la solution du sodium hypochlorite,
  l'acide chromique ou d'autres agents de
  nettoyage après le lavage dans l'eau distillé,
  les morceaux de réplique sont montés sur les
  grilles pour l'examen dans la microscopie
  électronique de transmission.
• Résultats
• - un petit morceau du réplica est montait sur
  une grille, vue aux grossissements successifs la
  première image dans la série montre le réplica
  comme vu sous le microscope binoculaire les deux
  images suivantes sont de très bas grossissement
  en MET (microscopie électronique de
  transmission) pour refléter des détails, le
  grossissement dans le microscope électronique est
  augmenté davantage.

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LA TECHNIQUE DE CRYODÉCAPAGE
Etapes de la technique de cryodécapage
Détails sur le protocole de travail
(une image miroir de la surface fracturée)
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LA TECHNIQUE DE CRYODÉCAPAGE

• Aplication pratiques
• le cryodécapage est unique parmi les techniques
  microscopiques car il fournit des vues planaires
  de l'organisation interne des membranes
• la corrosion profonde des échantillons rapidement
  congelés permettent la visualisation de la
  structure de surface de cellules et leurs
  composants
• les images fournies par le cryodécapage et les
  techniques collatérales ont changé profondément
  notre compréhension de la morphologie
  fonctionnelle de la cellule.

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CENTRIFUGATION (FRACTIONATION CELLULAIRE)

• La centrifugation est une technique utilisant la
  force centrifuge pour séparer des fluides de
  densités différentes ou pour isoler des éléments
  solides en suspension dans un fluide.
• Permet de séparer les éléments d'un mélange en le
  faisant tourner à grande vitesse.

Rotors a angle fixe pour les séparations les plus
simples entre culot (cellules, organites,
membranes, protéines plus ou moins agrégées selon
les cas) et le surnageant. Utilisé surtout pour
des séparations séquentielles, r des vitesses de
rotation croissantes.
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TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

• Chromatographie  est une méthode physique de
  séparation basée sur les différences d'affinités
  des substances à analyser à l'égard de deux
  phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre
  mobile.
• Selon la technique chromatographique mise en jeu,
  la séparation des composants entraînés par la
  phase mobile, résulte soit de leur adsorption et
  de leur désorption successives sur la phase
  stationnaire, soit de leur solubilité différente
  dans chaque phase.
• Phase de cromatographie
• Phase stationnaire  phase fixe sur la surface
  intérieure d'une colonne soit sur une surface
  plane.
• Phase mobile  phase qui se déplace à travers la
  phase stationnaire, en entraînant les analytes.
  La phase mobile ne doit pas interagir avec la
  phase stationnaire mais uniquement avec les
  analytes.
• Chromatogramme  graphique dune fonction de la
  concentration en analyte en fonction du temps (ou
  du volume) délution.
• La chromatographie analytique est utilisée pour
  identifier ou doser les composés chimiques d'un
  mélange et apprécier leur concentration.
• La chromatographie préparative est utilisée pour
  purifier assez de produit pour d'autres
  utilisations. Son but est d'obtenir de la
  substance  c'est pourquoi, à toute échelle, elle
  implique de collecter des fractions.

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TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

• Classification
• classification selon la nature de la phase
  mobile 
• la chromatographie en phase gazeuse (CPG)
  également appelée CPV (chromatographie en phase
  vapeur) 
• la chromatographie en phase liquide (CPL) 
• la chromatographie en phase liquide à haute
  performance (CLHP) 
• la chromatographie en phase supercritique (CPS).
• classification selon les interactions développées
  par la phase stationnaire 
• la chromatographie d'adsorption / d'affinité 
• la chromatographie de partage 
• la chromatographie à échange d'ions 

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TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

• Chromatographie en phase liquide
• La chromatographie en phase liquide (CPL) ou
  liquid chromatography (LC) est une technique
  d'analyse quantitative, qualitative et séparative
  principalement utilisée dans le domaine de la
  chimie analytique comme outil scientifique majeur
  mais aussi dans des domaines variés tels que la
  chimie organique et la biochimie. Elle recouvre
  la chromatographie sur couche mince (CCM), la
  chromatographie sur papier, la chromatographie en
  phase liquide en colonne ouverte ou à basse
  pression, et la chromatographie en phase liquide
  à haute performance (HPLC).Ce type de
  chromatographie repose sur la séparation de
  composés entraînés par un liquide (phase mobile)
  à travers un solide divisé (phase stationnaire)
  qui est soit placé dans un tube (colonne
  chromatographique), soit fixé sur une surface
  inerte.

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TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

• Chromatographie en phase gazeuse
• La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est,
  une technique qui permet de séparer des molécules
  d'un mélange éventuellement très complexe de
  nature très diverses. Elle s'applique
  principalement aux composés gazeux ou
  susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans
  décomposition. Elle est de plus en plus utilisée
  dans les principaux domaines de la chimie.
• Le mélange à analyser est vaporisé à l'entrée
  d'une colonne, qui renferme une substance active
  solide ou liquide appelée phase stationnaire,
  puis il est transporté à travers celle-ci à
  l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les
  différentes molécules du mélange vont se séparer
  et sortir de la colonne les unes après les autres
  après un certain laps de temps qui est fonction
  de l'affinité de phase stationnaire avec ces
  molécules.

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• La chromatographie sur papier
• La chromatographie sur papier est une technique
  de chromatographie en phase liquide.Pour
  effectuer une telle séparation, une petite
  quantité de la ou des solutions à analyser est
  déposée sur le bord d'une bande de papier de
  chromatographie. Cet échantillon est adsorbé par
  le papier  ce qui signifie que les molécules
  interagissent avec ce dernier et qu'elles auront
  tendance à rester au même endroit.
• Le papier est ensuite trempé dans un solvant
  (éluant) comme un mélange eau/éthanol et placé
  dans un récipient fermé. Pendant que le solvant
  (éluant) monte le long du papier par capillarité,
  il rencontre l'échantillon et l'entraîne.
• Les différentes substances constituant
  l'échantillon migrent à différentes vitesses
  selon qu'elles interagissent plus ou moins
  fortement avec le papier.
• Le résultat est appelé chromatogramme. Le
  chromatogramme est utilisé pour comparaison avec
  d'autres analyses effectuées sur des substances
  connues et prises dans des conditions identiques,
  pour identifier les substances de l'échantillon.
• La chromatographie sur papier peut aussi
  constituer une technique micro-préparative  pour
  récupérer les produits ainsi séparés, les
  portions du papier où ils se situent sont
  découpées et redissoutes ensuite. Les quantités
  récupérables sont de l'ordre du milligramme ou
  moins.

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TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

• application pratiques
• La chromatographie est utilisée
• dans les laboratoires d'analyses médicales par
  exemple pour évaluer la quantité de vitamines
  dans le sang
• dans le domaine sportif pour savoir si un athlète
  s'est dopé
• pour analyser les substances (poudres,
  liquides...) prélevées sur une scène de crime
  dans le cadre d'investigations en police
  scientifique (dans les études médico-légales)

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TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES

• La technique de l'électrophorèse est fondée sur
  le déplacement d'ions (molécules ayant perdu leur
  neutralité électrique) sous l'effet d'un champ
  électrique. Du fait de leurs caractéristiques
  propres et en fonction des conditions de
  l'électrophorèse ces ions auront des vitesses de
  migration différentes, ils vont donc se séparer
  les uns des autres.
• Les molécules anioniques (-) migrent vers l'anode
  () et les molécules cationiques () se déplacent
  vers la cathode (-).
• Les différents types d'électrophorèses de zones
  sont souvent nommés en fonction du type de
  support 
• électrophorèse sur papier 
• électrophorèse sur acétate de cellulose 
• électrophorèse sur gel (amidon, agar, agarose,
  polyacrylamide).

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TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES

• Gel d'électrophorèse
• est utilisée pour séparer les macromolécules
  biologiques en fonction de leur taille et de leur
  charge électrique
• le gel est constitué d'une matrice de polymère
  baignant dans un tampon conducteur.
• deux principaux polymères sont utilisés 
  l'agarose et le polyacrylamide. On peut faire
  varier la concentration de polymère par rapport à
  celle du tampon, ainsi que son taux de
  réticulation. Plus le polymère est concentré et
  réticulé, et plus la taille des pores du gel est
  petite. On peut ainsi ajuster les propriétés du
  gel à la taille des molécules à analyser.
• L'agarose est utilisé à des concentrations de
  0,5 à 2 (poids/volume) et permet de séparer des
  molécules de très grande taille, principalement
  de l'ADN ou de l'ARN 
• Le polyacrylamide est utilisé à des
  concentrations de 4 à 20 (poids/volume) et
  permet de séparer des molécules plus petites 
  protéines, peptides et des fragments d'acides
  nucléiques. On peut aussi faire varier sa
  réticulation (taux de ramification) lors de la
  polymérisation pour moduler les paramètres de
  séparation.

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TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES

• Extraction de l'ADN et séparation par
  électrophorèse

Matériel nécessaire
Le bleu de toluidine colore l'ADN
Cuves à électrophorèse Micropipetage de l'ADN
Début de migration de l'ADN dans le champ
électrique
Résultat de l'électrophorèse
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DIFFRACTOMÉTRIE DE RAYONS X

• La diffractométrie de rayons X (DRX) est une
  technique d'analyse basée sur la diffraction des
  rayons X sur la matière.
• La diffraction n'ayant lieu que sur la matière
  cristalline, on parle aussi de radiocristallograph
  ie. Pour les matériaux non-cristallins, on parle
  de diffusion.
• L'appareil de mesure s'appelle un diffractomètre.
  Les données collectées forment le diagramme de
  diffraction ou diffractogramme.
• Applications de la DRX
• - il est possible de la nature de chaque phase
  cristalline au sein d'un mélange (mélange de
  poudre ou échantillon massif polyphasique), à
  condition d'avoir auparavant déterminé la
  signature de chaque phase.
• - la méthode est qu'elle permet de distinguer
  les différentes formes de cristallisation d'un
  même composé. Cependant, elle ne peut
  généralement pas permettre d'identifier des
  composés amorphes. Cette technique est donc
  complémentaire de l'analyse élémentaire.
• - la méthode déterminer la identification de
  structures cristalline de lADN