PCR / RT

1
PCR / RT PCR / QRT-PCR
2
PCR

• Polymerase chain reaction (PCR) este o tehnica de
  biologie moleculara care presupune amplificarea
  exponentiala a unei mici cantitati de ADN.
• PCR a fost inventat de Kary Mulis si
  impreuna cu Michael Smith a obtinut premiul
  Nobel in 1993.
• Incepand cu o singura molecula de material
  genetic, PCR poate genera intr-o singura dupa
  amiaza 100 bilioane molecule similare. Reactia
  este usor de excutat necesita doar un tub,
  cativa reactanti si o sursa de caldura ( K.
  Mullis in Scientific American).

3
http//users.ugent.be/avierstr/principles/pcr.htm
l
4
(No Transcript)
5
Revers transcriere PCR

• Presupune amplificarea unei molecule de ARN
• ARN este trascris intr-o molecula de ADNc apoi in
  ADN dublu catenar
• Urmeaza procedeul de PCR clasic, care poate fi
  realizat intr-o etapa sau 2.

6
RT PCR
www.scielo.br/scielo.php?pidS1678-7757200400...
7
RT - PCR
http//www.bio.davidson.edu/Courses/immunology/Fla
sh/RT_PCR.html
8
QRT - PCR

• Real Time PCR cantitativ tehnica utilizata
  pentru a cuantifica si in acelasi timp pentru a
  amplifica o secventa specifica dintr-o molecula
  de ADN.
• AND-ul este cuantificat dupa fiecare fiecare
  ciclu de amplificare acesta este aspectul real
  time.
• Pentru cuantificare se folosesc
• coloranti fluorescenti care se intercaleaza in
  ADN-ul dublu catenar
• nucleotide ADN modificate care emit fluorescenta
  atunci cand sunt hibridizate de un ADN
  complementar
• QRT PCR poate fi folosit si pentru
  cuantificarea ARN

http//en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_
chain_reaction
9
Aplicatii ale QRT PCR

• Monitorizarea incarcaturii virale
• Quantificarea expresiei genice
• Discriminarea alelica
• Testarea GMO organisme modificate genetic.

10
QRT-PCR

• Cantitatea produsului de amplificat este direct
  proportionala cu intensitatea fluorescentei
• Semnalul fluorescent ajuta la calcularea
  cantitatii initiale de proba si poate fi
  masurat
• la sfarsitul reactiei (end point)
• in timpul amplificarii (Real Time QPCR)

11
Real Time QPCR

• Masoara fluorescenta dupa fiecare ciclu, in
  timpul procesului de amplificare
• Permite cuantificarea cantitatii initiale de
  proba in timpul amplificarii exponentiale,
  inainte de terminarea reactivilor, acumularea
  inhibitorilor sau inctivarea polimerazei

12
Real Time QPCR principiu

• O molecula fluorescenta monitorizeaza progresul
  reactiei de amplificare
• Intensitatea fluorescentei creste direct
  proportional cu multiplicarea ampliconului, dupa
  fiecare ciclu
• Ct (ciclu prag) primul ciclu la care sistemul
  optic poate detecta fluorescenta, ca urmare a
  amplificarii ampliconului.
• Cu cat este mai mare cantitatea de ADN initial in
  proba, cu atat Ct va fi mai mic.
• Daca se foloseste curba standard, softul va
  compara Ct standardelor cu Ct al probelor, si va
  determina concentratia de ADN initiala a fiecarei
  probe.

13
Instrumentele Stratagene QPCR
14
Caracteristicile Mx3005P

• 96 godeuri
• Sistem optic de scanare
• Sistem termic Pelter (uniformitate 0.25 C)
• Rata de amplificare a temperaturii2.5C / sec
• Sistem software pentru setarea placii, profilul
  termic, analiza finala.

15
Sistemul optic al Mx3005P
16
(No Transcript)
17
Scanare versus iluminare si scanare simultana
3.5 s scanning time per dye
18
Detectarea fluorescentei
19
Organizare softului
20

Plate Setup
SYBR Green 2-Fold Example.mxp
21

Thermal Profile Setup
SYBR Green 2-Fold Example.mxp
22

Raw Data Plots
SYBR Green 2-Fold Example.mxp
23

Consolidated Report
SYBR Green 2-Fold Example.mxp
24
Real Time PCR
25
(No Transcript)
26
PCR / fluorescenta
27
(No Transcript)
28
(No Transcript)
29
Chimia QRT - PCR

• SYBR Green
• TaqMan
• Molecular Beacons
• Sorpions TM

30
SYBR Green

• Avantaje
• Usor de folosit
• Ieftin
• Indicat pentru screning
• Dezavantaje
• Detecteaza orice ADN dublu din reactie

31
Selectia primerilor

• Obtinerea aceleiasi Tm pentru toti primerii
  ideal - 60 C
• 40 60 continut GC pentru a preveni
  autohibridizarea
• Utilizarea aceluiasi soft

32
Probe Taq Man

• Avantaje
• Secvente specifice
• Ofera posibilitatea de multiplexing (cuantificare
  comparativa)
• Dezavantaje
• Greau de optimizat
• Scump.

33
Probele lineare Taq man

• Tm al probelor trebuie as fie cu 5 10 C mai
  mari decat a primerilor
• Molecule reporter si quencher compatibile.

34
Schitarea experimentului QRT - PCR

• Optimizarea initiala trebuie sa identifice
  controale si standarde pe care sa se bazeze
  experimentele ulterioare

35
Strategia generala de optimizare a unui nou
experiment QRT - PCR

• Utilizarea SYBR Green
• Proiectarea ampliconilor in vederea utilizarii
  ulterioare a multiplexului.

36
(No Transcript)
37
(No Transcript)
38
(No Transcript)
39
Martori utilizati

• Martori pozitivi
• Probe care contin gena de interes si care va fi
  detectata (similar cu probele de investigat)

• Martori negativi
• No template control (NTC) lipsa ADN-ului in
  reactie
• No reverse transcription Control (NoRT)
• No amplification control (NAC) lipsa polimerazei

40
(No Transcript)
41
(No Transcript)
42
Concluzii

• Inainte de a analiza rezultatele, este important
  sa se verifice calitatea martorilor.
• Ideal, nici un martor negativ nu trebuie sa
  depaseasca pragul de fluorescenta stabilit
  (contaminarea primerilor).
• Daca martorii pozitivi nu arata amplificarea, se
  va pune in discutie daca probele negativate nu
  sunt de fapt rezultatul unei erori a reactiei PCR
  (prezenta inhibitorilor de PCR).

43
O primavara frumoasa!