ANTICUERPOS MONOCLONALES

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ANTICUERPOS MONOCLONALES HEMOCLASIFICADORES
Lic. René A. Rivero Jiménez, MSc.
INSTITUTO DE HEMATOLOGIA E INMUNOLOGIA
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SISTEMAS DE GRUPOS SANGUÍNEOS DE MAYOR
IMPORTANCIA CLÍNICA
ABO
RH
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Sistema ABO
1901 Primer sistema descubierto por Karl
Landsteiner
Solo dos antígenos, A y B podían explicar la
existencia de 4 grupos A, B, AB, O
Pero los antígenos A y B son el resultado del
funcionamiento sinergístico de dos sistemas
genéticos independientes El Hh, donde el gen
activo H (cromosoma 19) crea una enzima que
funciona añadiendo azúcares a un substrato
precursor, antes de la acción de los genes A y B
(cromosama 9)
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Sistema ABO
Antígeno H
Antígeno A
Antígeno B
Ceramida
Glucosa
Galactosa
N-acetilglucosamina
Fucosa
N-acetilgalactosamina
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Sistema ABO
Eritrocitos
Suero Genotipos Fenotiposa
Anticuerpos Glucosiltransferasas A1A1,
A1A2, A1O A1 Anti-B ?-3-N-acetilgalacto
saminil A2A2, A2O A2 Anti-Bb
?-3-N-acetilgalactosaminilc BB, BO B Anti-A
?-3-galactosil A1B A1B ---
?-3-N-acetilgalactosaminil y
?-3-galactosil A2B A2B ---b
?-3-N-acetilgalactosaminil y
?-3-galactosil OO O Anti-A y
Anti-B ---- Leyenda aDefinido por antisueros
anti-A, anti-B, y anti-A1. bAnti-A1 algunas veces
presente en el suero de individuos de los grupos
A2 y A2B. cN-acetilgalactosaminiltransferasas en
sueros del grupo A2 difieren en las propiedades
cinéticas de las enzimas en sueros del grupo A1.
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Sistema ABO
Fenotipo A1
Fenotipo A2
A
H
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Sistema ABO
Expresión antigénica Forma soluble
(secretores) Saliva y todos los líquidos
corporales, excepto el LCR Otras células
sanguíneas Linfocitos, plaquetas (adsobidos
del plasma). Tejidos En casi todas la
cel epiteliales (epitelio glandular) y sobre
células endoteliales. Amplia
distribución en tejidos (Histo- sanguíne
os)
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Sistema ABO
Los heterocigotos no se distinguen de los
homocigotos A1A1, A1A2 y A1O todos reaccionan
igual con Anti-A.
Frecuencia de los grupos ABO en Cuba Grupo
A A1 27,67 A2 8,26 variantes
débiles 0,75 B 11,2 AB A1B 2,28 A2B 0,81 O
49,03 Becomo AA et al. Rev Cubana Hematol
Inmunol Hemoter 1997 13(2) 124-131.
36,68
3,09
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Sistema ABO

• Características Generales de los Anticuerpos ABO
• Alta importancia clínica.
• Normalmente aparecen anticuerpos naturales en los
  individuos que no portan el antígeno en sus
  eritrocitos (evento único en la serología de los
  grupos sanguíneos).
• Se usan de forma habitual para la determinación
  de los grupos sanguíneos (grupo reverso).
• Son aglutininas frías usualmente clase IgM.
• Activan el Complemento.
• Causan hemólisis cuando son activos a 37 C
  (calientes).

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Sistema ABO

• Anticuerpos ABO
• Desarrollo con la edad
• En sangre de cordón umbilical Anti-A y Anti-B
  clase IgG de origen materno.
• Se detectan en lactantes entre 3-6 meses de
  nacidos (clase IgM).
• Mayor titulo se alcanza entre 5 y 10 años de
  edad.

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(No Transcript)
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Sistema Rh

• Se descubrió en 1940 por Weiner y Landsteiner.
• Después del ABO, el más importante en la clínica
• Anti-Rh causa reacción transfusional hemolítica
• Incompatibilidad madre-hijo enfermedad
  hemolítica del feto y del recien nacido.
• Se han descrito hasta 52 antígenos.
• Antígeno D define condición de POSITIVO.
• Otros antígenos C,c,E,e,d.
• Antígeno D mosaico antigénico, determinado por
  epitopos.

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Sistema Rh
Cromosoma 1p36.13-p34.3 Nombre de genes RHD,
RHCE Nombre del producto de los genes
polipéptido RhD, polipéptido RhCE. No. de exones
RHD 10, RHCE 10.
Expresión Eritrocitos de sangre de cordón. No
formas solubles. Tejidos
Específicos de la línea eritroide.
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Sistema Rh

• El polimorfismo del RhD es único.
• La mayoría de los que portan el gen D, tienen un
  polipéptido D completo.
• Pero existen variantes débiles, por expresión
  disminuída o incompleta.

Anticuerpos vs. Rh(D)
. Los aloanticuerpos anti-Rh(D) son inmunes por
su origen (no naturales). Clase IgG, usualmente
IgG1 y o IgG3. Pocas veces fijan
Complemento Aparecen en individuos D negativos o
en D parciales
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• Producción de reactivos hemoclasificadores
  basados en sueros humanos policlonales
• Cada lote es una mezcla diferente de moléculas
  obtenidas de distintos donantes.
• Cada lote se comporta de forma diferente frente a
  las expresiones débiles del Ag.
• Hay diferente avidez.
• Pueden presentar poli aglutinación frente al
  antígeno críptico Tn.
• Se requiere obtener un policlonal anti A,B, para
  corroborar la reactividad del Anti-A y del
  Anti-B.
• Se requieren técnicas manuales bien realizadas.

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Generación de hibridomas
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Ventajas de los Reactivos basados en AcM Cada
reactivo monoclonal es Una aglutinina
directa. Sólo una clase de Inmunoglobulina (IgM,
IgA o IgG). De sólo una especificidad
epitópica. De sólo una avidez No contiene Ac
contaminantes.
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Producción de los AcM Altamente laboriosa e
intensiva en la etapa de generación de
hibridomas, clonajes y caracterización de las
líneas célulares. Más simple en la etapa de
producción a gran escala.
Cada reactivo puede ser Un único AcM Una mezcla
de AcM Generalmente, los anti-A, anti-B y anti
A,B son mezclas., para que funcionen mejor en los
distintos métodos de hemaglutinación.
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Especificaciones para garantizar la calidad de
los reactivos hemoclasificadores basados en AcM

• Establecer la concentración o titulo de AcM y
  condiciones de la solución amortiguadora (pH,
  conc. Salina).
• Clonaje celular por 3 veces, garantía de la
  monoclonalidad.
• Crear bancos de células semilla Maestros y de
  Trabajo.
• Cada lote se debe generar a partir de un criotubo
  del hibridoma congelado. Cultivar y expandir las
  células mediante pases seriados por no mas de 3
  meses. Después de este tiempo desechar los
  cultivos.

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Errores que se deben evitar

1. AcM de alta afinidad pueden detectar los
   fenómenos B(A) o A(B) cantidades muy pequeñas
   del antígeno contrario presentes normalmente en
   algunos individuos. Solución diluir los AcM.
2. Algunos AcM anti-B detectan el Ag B adquirido (no
   el B real sino una estructura estérica muy
   similar, que produce alta reacción). Se adquiere
   por infecciones de algunas bacterias,
   enfermedades reumáticas, etc. Solución formular
   el reactivo en pH alcalino.
3. Algunos AcM producen reacción en monocapa en
   tubos y microplacas. Solución Tratar microplacas
   y tubos con Tween. Añadir albúmina o gelatina a
   la formulación en un bajo (albúmina como máximo
   3, gelatina como máximo 1). Mejor albúmina
   2-3, gelatina 0.05. Ayuda a la estabilidad del
   reactivo.

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Problemas para la obtención del anti-D monoclonal

• Mosaico D
• Ag D es un mosaico de mas de 30 epítopos.
• Cada AcM detecta un solo epítopo.
• No todas las células D expresan todos los
  epítopos de D.
• Du D normal pero con bajo numero de sitios en
  eritrocitos.
• Cada Anti-D monoclonal es diferente. Ningún AcM
  Anti-D detecta a todas las variantes, todos dejan
  algo.
• El problema es escoger al que detecta a los mas
  importantes epítopos para una correcta
  clasificación.
• Prueba de Anti-Globulina (Coombs) algunas
  variantes raras de D pueden dar FALSO POSITIVAS.
  En realidad no se deben transfundir con SANGRE
  Rh, ya que D completo inmuniza.

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• Ag D no es inmunogénico para ratones BALB/c
  imposible obtener monoclonales murinos anti-D.
• Si se inmunizan humanos, se obtienen AcM clase
  IgG (poco aglutinantes) se debe seleccionar
  moléculas IgG3 molécula mas abierta mejor
  aglutinante.

Producción de AcM anti-D humanos
Sangre de donantes inmunizados
AcM Anti-D IgG - IgM
Leucocitos VEB
Línea celular B transformada / -fusión
Clonajes
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• Reglas de Oro de la Calidad en reactivos
  hemoclasificadores
• Nivel seguro en el titulo de anticuerpos.
• La especificidad, potencia, y avidez dependen de
  la concentración.
• Medición de la concentración de Ac por ELISA. Ej.
  Uso de conjugado anti-IgM o IgG de ratón.
• Garantía del pH final del producto rango general
  6.5-7.2.
• Se adiciona HEPES cuando se cosechan los
  sobrenadantes.
• Fortaleza iónica elevada, incrementa la actividad
  del reactivo.

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ADITIVOS EDTA previene la lisis, especialmente
en eritrocitos no lavados. También previene la
degradación por proteolisis Gelatina mejora la
avidez, evita que los Ac formen monocapa con
eritrocitos. Colorantes Coloración intensa puede
afectar resultados en microplacas.
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Control de Calidad Chequeo sistemático para
demostrar que todo se hizo correctamente en la
producción Pruebas Especificidad Reacción
completa 4 Potencia A o B 1/64 con fenotipos
fuertes A1 o B Titulación con 2 de SAB 1/8-16
con fenotipos débiles A2B o A1B para
mantener la conc. de proteínas mientras se
diluye. Avidez según protocolo 5-10
segundos. Adicional medir concentración de
azida, conc. proteínas, pH y fuerza iónica.
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Métodos de Producción En animales de
experimentación Liquido ascítico murino
(LAM). Ej. Anti-A, Anti-B. En biorreactores de
fibra hueca Todos, pero en particular el
anti-D.(Mejores que los tanques agitados para la
concentración de Ac). Chequear niveles de glucosa
en el medio. Comenzar con SFB 5 y disminuir
hasta 1 en el espacio extracapilar (las células
y el SBF deben estar en el EE, mientras el medio
se bombea al espacio intracapilar. La estabilidad
de las líneas celulares mejora con los
reclonajes. NUEVAS TECNOLOGIAS Bibliotecas de
fagos. Fragmentos de anticuerpos. Ingeniería de
anticuerpos.
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Nos vemos en Hematología Habana 2005!! Mayo
16-20, 2005
4to Congreso de la Sociedad Cubana de Hematología