Hu?ng d?n k? thu?t l?y m?u, b?o qu?n v

1
Hu?ng d?n k? thu?t l?y m?u, b?o qu?n và v?n
chuy?n b?nh ph?m cúm A

• ThS. Nghiêm M? Ng?c
• Khoa Xét Nghi?m
• B?nh vi?n B?nh Nhi?t Ð?i
• Tháng 04 nam 2014

2
N?i dung

• M?c dích và t?m quan tr?ng c?a vi?c l?y m?u xét
  nghi?m
• Phuong pháp l?y m?u, b?o qu?n và v?n chuy?n b?nh
  ph?m cúm A
• Xét nghi?m ch?n doán virus cúm A

3
M?c tiêu l?y m?u xét nghi?m

• Xác d?nh ca b?nh
• Xác d?nh ? d?ch do virus
• Theo dõi s? bi?n d?i gen c?a virus
• Phát hi?n d?t bi?n kháng thu?c

4
Nguyên t?c l?y b?nh ph?m

• Ð?m b?o ch?t lu?ng c?a xét nghi?m virus cúm
  A/H7N9
• Th?i di?m l?y b?nh ph?m
• Lo?i b?nh ph?m
• Ch?t lu?ng c?a b?nh ph?m
• Ði?u ki?n b?o qu?n và v?n chuy?n b?nh ph?m
• Ð?m b?o các quy t?c an toàn sinh h?c
• L?y b?nh ph?m
• V?n chuy?n b?nh ph?m
• Th?c hi?n xét nghi?m cúm A/H7N9

5
Tiêu chu?n ch?t lu?ng m?u b?nh ph?m

• Ðúng th?i di?m
• 3 ngày d?u c?a b?nh
• Tru?c khi dùng thu?c kháng virus
• Ðúng ch?ng lo?i
• Ðúng thao tác
• B?o qu?n và v?n chuy?n b?nh ph?m dúng cách

6
B?nh ph?m xét nghi?m cúm A
M?c tiêu phát hi?n Lo?i b?nh ph?m K? thu?t xét nghi?m
V?t li?u di truy?n RNA c?a virus T? bào bi?u mô du?ng hô h?p D?ch ti?t du?ng hô h?p - RT PCR - Real time RT-PCR - Nucleotide sequencing
Kháng nguyên virus T? bào bi?u mô du?ng hô h?p D?ch ti?t du?ng hô h?p - Test nhanh - Mi?n d?ch s?c kí
Virus toàn v?n T? bào bi?u mô du?ng hô h?p D?ch ti?t du?ng hô h?p C?y phân l?p trên t? bào ho?c phôi tr?ng gà
Kháng th? kháng virus Huy?t thanh - Hemagglutination Inhibition Test. - Micro-Neutralization Assay
7
B?nh ph?m xét nghi?m cúm A

• Ðu?ng hô h?p trên
• D?ch h?ng
• D?ch mui
• D?ch t? h?u
• Ðu?ng hô h?p du?i
• D?ch n?i khí qu?n
• D?ch ph? nang
• Huy?t thanh
• Giai do?n c?p
• Giai do?n h?i ph?c
• (2 m?u cách nhau 10-14 ngày)

8
K? thu?t l?y m?u, b?o qu?n và v?n chuy?n b?nh
ph?m cúm A

• Chu?n b? thu th?p b?nh ph?m
• D?ng c?, môi tru?ng
• Phi?u thu th?p b?nh ph?m
• S? d?ng trang ph?c b?o h? cá nhân

9
D?ng c? - môi tru?ng

• D?ng c? thu th?p b?nh ph?m
• Tam bông vô trùng
• Dây nh?a m?m (catheter)
• Cây dè lu?i
• Dây garo
• Bom tiêm vô trùng
• Túi nylon d? gói b?nh ph?m
• Bình l?nh b?o qu?n m?u
• Dung d?ch sát trùng ethanol 70, chlorine
  (Sodium hypochlorite) ho?c Chloramine B

10
D?ng c? - môi tru?ng

• Môi tru?ng v?n chuy?n virus
• Do Vi?n Pasteur TPHCM ho?c BV. B?nh Nhi?t Ð?i
  cung c?p
• Thành ph?n albumine bò, kháng sinh, kháng vi
  n?m, phenol red
• B?o qu?n ? 2-8oC
• KHÔNG dùng khi môi tru?ng có màu d?c hay chuy?n
  t? màu h?ng sang tím ho?c vàng

Môi tru?ng v?n chuy?n virus (VTM)
11
Phi?u thu th?p b?nh ph?m

• Ph? l?c 6, thông tu 43/2011/TT-BYT ngày 5/12/2011
  c?a B? tru?ng B? Y t?
• Bao g?m thông tin
• B?nh nhân
• Lo?i b?nh ph?m
• Ngày thu th?p
• D?ch t?
• G?i kèm theo m?u b?nh ph?m

12
Hu?ng d?n cách l?y b?nh ph?m

• D?ch mui
• Ðua tam bông vào d?c theo sàn mui t?i khoang mui
  h?ng
• Ð? tam bông th?m u?t d?ch mui
• Xoay tròn, mi?t m?nh vào thành mui và rút ra t?
  t?
• Cho tam bông vào l? d?ng m?u dã có s?n môi tru?ng
  v?n chuy?n.

Ch?t lu?ng ch?n doán t?t hon ph?t h?ng d?i v?i
cúm ngu?i
13
Hu?ng d?n cách l?y b?nh ph?m

• D?ch h?ng
• Ðua tam bông vào vùng h?u h?ng d? cho d?ch th?m
  u?t d?u tam bông.
• Mi?t m?nh và xoay tròn tam bông t?i khu v?c 2
  amidan và thành sau h?ng
• Cho tam bông vào l? d?ng m?u có môi tru?ng v?n
  chuy?n.

Ch?t lu?ng ch?n doán t?t hon ph?t mui d?i v?i cúm
A/H5N1
14
Hu?ng d?n cách l?y b?nh ph?m

• D?ch mui h?u (NPA)
• N?i d?ng c? l?y m?u v?i h? th?ng hút chân không
• Ðua catheter vào mui theo hu?ng song song v?i vòm
  mi?ng, d? sâu b?ng du?ng n?i mui, tai.
• T? t? dua catheter ra ngoài v?a dua ra v?a xoáy.
• Tuong t? nhu v?y v?i mui bên kia, có th? s? d?ng
  chung m?t catheter.
• Hút 3 ml dung d?ch v?n chuy?n d? r?a catheter,
  chia m?u vào l? d?ng m?u.

Cho k?t qu? nh?y hon ph?t mui/ ph?t h?ng T?i uu
cho xét nghi?m cúm A (WHO)
15
Hu?ng d?n cách l?y b?nh ph?m

• D?ch n?i khí qu?n     
• Dùng 1 ?ng hút d?ch d?t theo du?ng n?i khí qu?n
• Dùng bom tiêm hút d?ch n?i khí qu?n theo du?ng
  ?ng dã d?t t? 1-2 ml
• Chuy?n d?ch khí qu?n vào ?ng ch?a s?n 3 ml môi
  tru?ng v?n chuy?n virus

D?ch khí qu?n trong VTM
16
Hu?ng d?n cách l?y b?nh ph?m

• M?u huy?t thanh (phát hi?n kháng th?)
• L?y 3-5 ml máu tinh m?ch cho vào l? không có ch?t
  ch?ng dông
• Ly tâm m?u máu t?c d? th?p 2000 v/p d? tách huy?t
  thanh
• L?y máu kép
• Máu 1 l?y càng s?m càng t?t
• Máu 2 l?y cách 10-14 ngày

M?u huy?t thanh
17
B?o qu?n m?u b?nh ph?m cúm

• Gi? trong môi tru?ng v?n chuy?n virus (VTM)
• Nhi?t d? thích h?p
• 4oC trong 48 gi?
• - 70oC ho?c -20oC trên 48 gi?
• H?n ch? làm dông và rã dông b?nh ph?m nhi?u l?n

Môi tru?ng v?n chuy?n virus (VTM)
18
B?o qu?n m?u b?nh ph?m cúm

• M?u huy?t thanh (phát hi?n kháng th?)
• Sau khi quay ly tâm b?o qu?n trong t? l?nh
  4oC-8oC trong vòng 10 ngày
• N?u không có di?u ki?n ly tâm b?o qu?n trong t?
  l?nh 4oC trong 24 gi?
• N?u c?n b?o qu?n lâu hon -20oC ho?c -80oC
• Không làm dông và rã dông nhi?u l?n

19
Cách ghi nhãn và phi?u xét nghi?m

• Dán nhãn trên m?i l? b?nh ph?m ghi mã s?, h?
  tên, tu?i b?nh nhân, lo?i b?nh ph?m, ngày l?y
  b?nh ph?m
• Ði?n d?y d? thông tin vào phi?u xét nghi?m
• Trên các bao bì b?nh ph?m ph?i ghi tên lo?i b?nh
  ph?m

Nhãn
(B?NH PH?M CH?N ÐOÁN ho?c B?NH PH?M LÂM SÀNG)
20
Nguyên t?c dóng gói b?nh ph?m cúm

• M?u b?nh ph?m ph?i du?c dóng gói ba l?p
• L?p th? nh?t không th?m nu?c, không rò ri, có
  ch?a v?t th?m nu?c.
• L?p th? hai b?ng v?t li?u b?n, không th?m nu?c
  (túi nilon), không rò ri.
• L?p ngoài cùng d?m b?o ch?u l?c, ch?ng va ch?m.
  Gi?a l?p th? hai và l?p ngoài cùng có 1 l?p d?m
  ch?ng va d?p

21
Nguyên t?c dóng gói b?nh ph?m cúm

• Ðóng gói riêng bi?t v?i các lo?i hàng hóa khác
• Các ?ng b?nh ph?m ph?i du?c d?t th?ng d?ng
• Khi d?ng nhi?u m?u trong l?p th? hai tách riêng
  m?u, tránh ti?p xúc
• Ghi nhãn trên bao bì v?n chuy?n
• Nhi?t d? b?o qu?n
• Tên lo?i b?nh ph?m
• Thông tin ngu?i g?i và ngu?i nh?n tên, d?a ch?,
  s? di?n tho?i
• G?i kèm phi?u xét nghi?m và phi?u di?u tra d?ch
  t?

22
V?n chuy?n b?nh ph?m cúm

• Do nhân viên y t? th?c hi?n
• Thông báo cho phòng thí nghi?m ti?p nh?n
• Phuong ti?n v?n chuy?n
• Th?i gian d? ki?n s? t?i phòng thí nghi?m
• L?a ch?n phuong ti?n v?n chuy?n d?m b?o th?i
  gian v?n chuy?n ng?n nh?t.
• Các ch?t b?o qu?n b?nh ph?m trong quá trình v?n
  chuy?n (dá u?t, dá khô)
• Phù h?p các yêu c?u v? an toàn khi v?n chuy?n
• Ð?m b?o ch?t lu?ng b?nh ph?m

23
Xét nghi?m và thông báo k?t qu? xét nghi?m

• Ðon v? xét nghi?m kh?ng d?nh virus cúm A/H7N9
• Vi?n V? sinh d?ch t? trung uong
• Vi?n Pasteur TP. H? Chí Minh
• Ðon v? l?y m?u xét nghi?m Trung tâm Y t? d?
  phòng các t?nh, thành ph?, các b?nh vi?n
• L?y m?u b?nh ph?m các tru?ng h?p nghi ng? do
  virus cúm A/H7N9
• Ðóng gói và v?n chuy?n d?n phòng xét nghi?m

24

Xét nghi?m ch?n doán viêm ph?i do virus cúm A
25
Xét nghi?m sinh hóa-huy?t h?c

• Công th?c máu ngo?i vi
• M?t s? tru?ng h?p s? lu?ng t? bào TCD4 gi?m lt 200
  t? bào /mm3
• Khí máu
• Gi?m oxy máu khi b?nh ti?n tri?n n?ng
• Men gan
• Tang men gan m?c d? nh? ho?c trung bình
• Ðu?ng huy?t
• M?t s? tru?ng h?p có tang du?ng huy?t
• Tang creatinin trong tru?ng h?p suy th?n

26
Xét nghi?m vi khu?n

• M?c dích
• Ch?n doán phân bi?t v?i b?nh do vi khu?n (viêm
  ph?i do ph? c?u, vi trùng lao,)
• Phát hi?n tru?ng h?p b?i nhi?m
• Phuong pháp
• C?y máu
• Soi-c?y dàm và d?ch ph? qu?n
• C?y d?ch màng ph?i.

27
Xét nghi?m virus cúm A

• Phuong pháp nuôi c?y
• Phuong pháp không nuôi c?y
• Hình thái h?c
• Mi?n d?ch h?c
• Di truy?n h?c

Phôi gà
T? bào MDCK
28
Ð?c di?m virus cúm A

• Phân nhóm theo 2 kháng nguyên
• Hemagglutinin (HA) 16H
• Neuraminidase (NA)9N
• Gia c?m có t?t c? H và N
• Ngu?i ch? có H1, H2, H3 và N1, N2

29
Th? thách trong ch?n doán virus cúm A
1918 Spanish Flu
1957 Asian Flu
1968 Hong Kong Flu
30
Th? thách trong ch?n doán virus cúm A

• Cúm A ch?ng pandemic H1N1 2009
• Cúm A ch?ng S-OtrH3N2 2011
• Cúm A/H5N1 (cúm gia c?m)
• Cúm A/H7N9

31
Quy t?c v? an toàn sinh h?c trong phòng Xét nghi?m

• X? lý m?u b?nh ph?m cúm A
• Class II biological safety cabinets
• Nuôi c?y, phân l?p virus
• Lab an toàn sinh h?c c?p d? 3 (Biosafety Level 3
  Lab)

32
B?nh vi?n B?nh Nhi?t Ð?i TP.H? Chí Minh
Ch?ng nh?n phòng xét nghi?m Sinh H?c Phân T?
Ch?ng nh?n phòng Xét nghi?m An toàn sinh h?c c?p
d? III
33
Quy trình xét nghi?m virus cúm A t?i BV. B?nh
Nhi?t Ð?i

• S? d?ng quy trình Real-time RT-PCR c?a CDC
• Th?i gian tr? k?t qu? 24 gi?
• Ð?t chu?n ISO15189
• Tham gia chuong trình ngo?i ki?m c?a WHO

34
Nguyên lý PCR (Polymerase Chain Reaction)
35
Quy trình xét nghi?m virus cúm A (Quy trình CDC)
Ð?nh danh virus cúm A (H1, H3, H5, H7)
Ð?nh danh virus cúm A (N1, N9)
Ch?n doán virus cúm A
Ch?n doán virus cúm B
36
Quy trình xét nghi?m virus cúm A
Tách chi?t RNA virus
H7
N9
37
Bi?n lu?n k?t qu?

• Ph?i h?p v?i y?u t? d?ch t? và b?nh c?nh lâm sàng
• B?nh nhân ph?i du?c cách ly ch? k?t qu?
• M?t k?t qu? PCR âm tính không lo?i tr? du?c b?nh

38
Tiêu chu?n ch?t lu?ng m?u b?nh ph?m

• Ðúng th?i di?m
• 3 ngày d?u c?a b?nh
• Tru?c khi dùng thu?c kháng virus
• Ðúng ch?ng lo?i
• Ðúng thao tác
• B?o qu?n và v?n chuy?n b?nh ph?m dúng cách

39
Chân thành c?m on