RESISTENCIAS A LOS F

1
RESISTENCIAS A LOS FÁRMACOS ANTIRRETROVIRALES.
M. Riera. Unitat de Malalties Infeccioses. Hospit
al Son Dureta.
2
Definición de resistencia a antirretrovirales

• El concepto de resistencia farmacológica en
  enfermedades infecciosas es por definición
  fenotípico, se reconoce in vitro por la necesidad
  de una mayor concentración del fármaco para
  inhibir a la mitad (IC50) o al 90 (IC90), el
  grado de crecimiento del virus en cultivos
  celulares.
• La resistencia es consecuencia de mutaciones que
  emergen en las proteinas virales donde actuan los
  antirretrovirales.

3
Como aparecen cepas resistentes en un paciente?

• Resistencias primarias o transmitidas Son las
  que aparecen en pacientes naive (que nunca han
  seguido TAR.)
• Resistencias secundarias Aparecen en pacientes
  que han recibido tratamientos antirretrovirales,
  generalmente como consecuencia de tratamientos
  insuficientemente supresores.

4
Prevalencia de mutaciones transmitidasCohorte
CASCADE. B.Masquelier.JAIDS 2005

• Cohorte de 6327 seroconversores de Europa y
  Canada, de los cuales a 438 se realizó GRT en los
  18 meses de la seroconversión.
• 45 (10,3 ) infectados por cepas VIH- con
  resistencia a fármacos antirretrovirales.
• Los pacientes seroconversores más recientes
  (2000-2003) mayor riesgo de TDR,RR 4,49 CI95
  1,03-23

5
Prevalencia de resistencias primarias en
pacientes con seroconversión reciente
6
Porque aparecen resistencias secundarias a los
fármacos antirretrovirales?
Tratamientos de rescate
Fracaso virologico
7
Resistencias secundariasProgresion clínica y
respuesta virológica en la cohorte
SuizaLedergerber B.Lancet 1999353863

• Un 90,7 de los pacientes naive alcanzaron CV
  indetectables a los 12 meses frente al 70-78,7
  pretratados.
• A los 2 años un 20,1 de los pacientes naive
  presentaran fracaso virológico y un 35.7-40.1 de
  los pretratados.
• La probabilidad de alcanzar cargas virales
  indetectables con un tratamiento de rescate fue
  del 57,1.

8
Epidemiologia. Prevalencia en pacientes
tratados.HIV Cost and Service Utilization Study
Cohort.D.D.Richman AIDS 2004
9
Utilización practica de los test de resistencia
genotípica al VIH-1 en tratamientos de
rescate.HSD.1999-2001

• 198 pacientes (15)
• de los seguidos en consultas precisaron
  pruebas de resistencia genotípica por FV.
• 49 de los pacientes presentaban gt3 TAMs y 49
  tenían 5 o más mutaciones a IPs

10
Dinamica viral y generación de mutantes
En pacientes con infección VIH no tratada , el
numero total de celulas infectadas del tejido
linfoide se calcula en 107 o 108
La vida media de las celulas infectadas es de 1 o
2 días, el VIH debe infectar nuevas células con
un turnover muy rápido
Las mutaciones aparecen al azar fundamentalmente
como consecuencia de la falta de fidelidad de la
TI y de la elevada replicación viral
11
Dinamica viral y generación de mutantes
La rapidez con que una población mutante
sustituye a una población sensible a un TAR
depende de -Nº de mutaciones que se requieren
para proporcionar un alto nivel de
resistencias. - El coste cinético
El VIH es capaz de persistir en células de vida
media larga, por lo que se mantendrá un archivo
histórico de todos los genotipos que ha tenido
un paciente a lo largo del tiempo
12
Mecanismos de resistencia

• El origen molecular de la aparición de
  resistencias a un determinado grupo de
  antirretrovirales se debe a la presencia de
  mutaciones sobre el gen que actuan (T I o la
  proteasa).
• Los ANTI después de ser fosforilados por las
  quinasas celulares, son incorporados a la TI en
  la cadena naciente de DNA viral. Debido a que
  estos fármacos no contienen un grupo hidroxilo en
  la posición 3 del azucar, interrumpen la
  síntesis de DNA.

13
Mecanismos moleculares de resistencia a los
ANTI. Cambio de la afinidad de la TI por los ANTI

• Algunas mutaciones cercanas al sítio catalítico
  de la enzima impiden la incorporación del ANTI al
  DNA por pérdida de afinidad de la TI por el ANTI
  (incorpora mucho menos eficazmente el ANTI que el
  dNTP o sustrato natural, por alteraciones en las
  interacciones entre la TI y el inhibidor en el
  sitio catalítico de la enzima).

• M184V (3TC) , L74V (ddI),
• K65 R (TFV, ddI)
• Q151M (multirresistencia a ANTI)

14
Mecanismos resistencia a los ANTIAumento de la
pirofosforolisis

• Las mutaciones TAM thymidine analogue mutations
  (asociadas al uso de AZT,d4T), aumentan la
  capacidad de la TI para eliminar el
  AZT-monofosfato incorporado, permitiendo que
  continue la síntesis de ADN.El ATP es el sustrato
  fisiológico relevante para las reacciones de
  rescate de iniciadores bloqueados con ANTI.
• TAMs Disminuyen la sensibilidad al
  AZT,d4T,ddi, abacavir o TFV.
• D67N /K70R /T215F/ K219E/Q/N
• M41L/L210W/T215Y
• TI portadoras de inserciones de dos aminoácidos
  entre los codones 69 y 70 69ss

15
Mecanismos moleculares de resistencia a los ATINN
Los ATINN se situan en el interior de la molécula
de la TI en un dominio hidrofóbico cercano al
sitio catalítico, produciendo un cambio
conformacional en la estructura de la TI que
impide la polimerización del DNA La resistencia
a los ATINN se debe a la pérdida de interacciones
hidrofóbicas que estabilizan la unión de la TI
con el ATINN.
Mutaciones en las posiciones 100,101,103, 106,
108,138, 181, 188, 190, 221, 225, 227, 230, 236,
238 se asocian a resistencias a los ANNTI
16
Mecanismos de actuación de los IP
La PR es un homodímero constituido por dos
cadenas polipeptídicas de 99 aminoácidos y una
hendidura en la zona de contacto de ambas
subunidades. La PR del VIH actúa procesando dos
de las poliproteinas precursoras del virus (Gag y
Gag-Pol) dando lugar a proteinas estructurales
del virus maduro. Todos los IP comercializados
son moléculas sintéticas que se unen al centro
activo de la enzima compitiendo con los sustratos
naturales.
17
Mecanismos de resistencia a los IP

• La PR tiene una gran plasticidad lo que le
  permite mutar en numerosas posiciones sin perder
  su actividad enzimática. Las mutaciones modifican
  el nº y la naturaleza de los puntos de contacto
  entre la proteasa y los IP, reduciendo su
  afinidad por la enzima.
• Las mutaciones primarias Afectan al lugar de
  unión de las proteasas a su sustrato y conducen a
  cambios en los aminoácidos que disminuyen su
  afinidad por el fármaco.
• Las mutaciones secundarias Aparecen
  posteriormente alejadas del sitio activo aumentan
  el grado de resistencia y la capacidad
  replicativa del virus y son compartidas por la
  mayoría de inhibidores de la proteasa
• .

MUTACIONES SECUNDARIAS
MUTACIONES PRIMARIAS
L10F/R ,K20V/I/T, Ll23I, ,L24I, V32I, L33F, E34Q,
E35G, M36I, K43T, I47V, F53L,I54L/M/V, Q58E,
L63P,I66F, A71V/T, G73S/A/T/C,T74
S/P/A,L76V ,V77I, P79A,I85V,N88 D/S.L89V, Q92R,
C95F
D30 N, M46I/V, G48V/M I50V/L, V82A/F/T/S,
I84V/A/C. ,L90M
RHEE SY, JID 2005-BD STANDFORD
18
Mutaciones in vitro Mutaciones naive IP
SQV G48V,L90M,, 54, 73, 71, 77, 82,84 L90M ,I84V, V82A/F/T, I62V,L24I G48V mut secund
NFV D30N, L90M, 10, 38,46, 71, 77, 82, 84, 88 D30N, 20M,M3I,M46L,A71V,V77I,N88S L90M, 20M,M3I,M46L,A71V,V77I,N88S
APV/Fosr I50V, I84V, 10, 32, 46, 54, I50V, I47V,M46I I84V
ATV V32I,M46I,I84V,N88S I50L, A71V
LPV/r L84V,L10F,M46I,T91S,V32I,L47V V82A,V32I,M46L,I47A
TPV/r L33F, K45L,, V82L, I84V L10F, I13V,V32I, I54V L10I/V/S,L33F/I/V, I84V, V82I,T
Con IP potenciados son fármacos de alta barrera
genética y con buen perfil farmacocinético, en
naive o en simplificación con monoterapia Ausenci
a de aparición de mutaciones primarias en los
ensayos clínicos y resupresión tras
reintroducción LopinavirM98-863. Kempf, J Inf
Dis 2004 Estudio OKEY JR.Arribas, JAIDS
2005 FosamprenavirSOLO. McManus,AIDS 2004
Atazanavir vs ATZ/r (098).Malan N .y ACTG
A5201 Swindells S. CROI 2006.
19
Enfuvirtide (ENF, T-20)

• ENF es un péptido de 36 aa que mimetiza parte de
  la secuencia del dominio externo en la región
  HR2 de la proteina de envoltura transmenbrana
  gp41.
• ENF actúa extracelularmente bloqueando la fusión
  de las membranas del VIH con el CD4.
• Se une al dominio HR1 de la gp41.
• Impide la formación de la hexahélice HR1-HR2,
  cambio necesario para la fusión de menbranas.

ENF
20
Frecuencia de Mutaciones en gp41 aa 36-45.
(Patientes en TORO 1 TORO 2).
60
de Pacientes con Muts.
40
20
0
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
G
I
V
Q
Q
Q
N
N
L
L
Secuencia WT
21
Mecanismos de resistencia a nivel celular

• Resistencia a nivel de los mecanismos de
  fosforilación intracelular.
• Acción de las proteinas transportadoras de
  transmenbrana , las glicoproteinasP, gpP,
  codificadas por el gen MDR y las MRP
  (MRP-1,MRP-4, MRP-5) pueden transportar los ATIN
  y los IP fuera de las células por un mecanismo de
  bombas de excreción.

22
Métodos de medición de resistenciasMétodos
genotípicos

• Se encuentran disponibles en laboratorios
  asistenciales, comerciales y de investigación
• Analiza las secuencias de la transcriptasa
  inversa, de la proteasa y de la envoltura del
  VIH-1 e identifica las mutaciones implicadas en
  la reducción de susceptibilidad a los TAR.
• Las mutaciones están expresadas en términos de
  sustitución de aminoacidos en la cadena
  polipeptídica de la proteína diana.
• M184V (el cambio de una adenina por una guanina
  en el codón 184 de la región de la TI conlleva
  la sustitución de metionina por Valina)

23
Métodos genotípicos

• La primera fase en estos tests es amplificar el
  ARN viral mediante RT-PCR de los genes de TI y de
  la Proteasa.
• Las secuencias de los productos de la PCR (que
  representa las secuencia viral predominante en la
  muestra), puede analizarse
• Secuenciación de todos los codones relevantes.
• Detección de mutaciones puntuales

24
Secuenciación genómica

• Los productos secuenciados se detectan mediante
  electroforesis.
• Las secuencias obtenidas se comparan con
  secuencias de referencia de VIH-1 mediante
  diferentes programas informáticos para determinar
  la presencia de mutaciones.
• Es el método de referencia
• Dos métodos homologados y comercializados de
  secuenciaciónViroSeq HIV-1 (Abott), TruGene
  HIV-1 (Bayer)

25
Características de los métodos genotípicos
INNO-LIPA (Bayer) TruGene (Bayer) ViroSeq (Abbot) GeneSeq (Virologic)
Muestra Plasma Plasma,LCR,tej linfoide Plasma,LCR,tej linfoide Plasma
Limite sensibilidad 500 cop/mL 1000 cop/ml 1000 cop/mL 500 cop/mL
Tiempo de realización 2 días 3 días 3 días 14 días
Secuencia analizada Mutaciones puntuales de la PR y TI PR (1-99) TI (1-247) PR (1-99) TI (1-320) PR (1-99) TI (1-305)
Detección de cuasiespecies minoritarias 4-8 10-20 10-20 10-20
26
Consideraciones en la valoración de resistencias
Fármacos con alta -baja barrera genética

• Para algunos fármacos la aparición de una sóla
  mutación puede conferir un alto nivel de
  resistencia, son fármacos con baja barrera
  genética Nevirapina, Efavirenz, Lamivudina.
• Para la mayoría de ANTi y de IPs la aparición de
  resistencia es un proceso gradual. La acumulación
  de mutaciones da lugar a un incremento progresivo
  en los niveles de resistencia y raramente se
  alcanza un nivel de resistencia absoluto.
• La cinética de aparición de resistencias
  dependerá de la farmacocinética, la
  farmacodinámica y la barrera genética..

27
Consideraciones en la valoración de resistencias
en la practica clínica II

• La adquisición de mutaciones de resistencia, a
  menudo se asocian a una disminución de la
  capacidad replicativa viral.
• Algunas mutaciones pueden suprimir la resistencia
  fenotípica de otra mutación, restaurando la
  susceptibilidad a otros fármacos. (Ejemplo
  mutaciones que aumentan susceptibilidad al AZT)
• En el curso de los tratamientos pueden producirse
  resistencias cruzadas (un virus resistente a un
  antiviral muestra resistencia a otros fármacos,
  de la misma familia, con los que no ha estado en
  contacto.)

M184V
K65R,L74V, M184V L100I y 181C
Multi-ATINN Resistencia K103N / Y 188
L Multi-ATIN Resistencia Q151M, T69ss,
acumulación de mut41,67,70,184,210,215,219
28
Efecto de la acumulación de TAMs y la presencia
de la mutación M184V la sensibilidad a los
ANTIWhitcomb JID 2003
29
Resistencias cruzadas. Acumulación de mutaciones
, perdida de sensibilidad a las proteasas

• Con IP no potenciados la duración del tratamiento
  con IPs en fracaso virológico es predictivo del
  nº de IPs con sensibilidad disminuida. Kemper C.
  AIDS 200
• De 6000 muestras clínicas de pacientes en FV,
  entre el 17-25 presentaban resistencia a IPs y
  692 (11) presentaban alto nivel de resistencia a
  los 4 IPs analizados, las mutaciones más
  frecuentes en estos pacientes fueron
• Hertog K.AIDS 2000

30
TPV RESIST Cambios en CV a 24 semanasSegún
mutaciones de proteasa basales
?
?
Median log10 HIV RNA change from baseline
lt0.0001
0.0105
lt0.0001
lt0.0001
P
Numero de mutaciones de proteasa Cualquier
cambio de la secuencia consenso de la proteasa
31
Estudios prospectivos sobre la utilidad de los
estudios de resistencias.
32
Limitaciones de los estudios de genotípicos

• No detectan poblaciones virales minoritarias, no
  detectan la presencia de especies resistentes
  archivadas.
• Miden indirectamente las resistencias
  fenotípicas, puede no existir correlación con el
  análisis fenotípico.
• Difícil interpretación. Requiere del
  conocimiento de los determinantes genéticos de
  las resistencias.
• Se desconoce el efecto de determinadas
  combinaciones de mutaciones sobre el fenotipo.
• Se desconoce el impacto de cada mutación para un
• determinado ARV

33
Interpretación de los resultados genotípicos

• El estudio HAVANA demostró una mayor respuesta
  virológica si el genotipo es interpretado por un
  grupo de expertos, en comparación a los pacientes
  en los que el tratamiento es modificado sólo en
  base al genotipo.
• Diversos sistemas informáticos expertos están
  disponibles en internet y pueden ser de ayuda en
  la interpretación del genotipado.
• http//hivdb.stanford.edu
• http//www.vircolab.com
• http//www.retrogram.com
• http//www.hivfrenchresistance.org/index.html
• http//www.trugene.com

34
Interpretación de resistencias genotípicas
Future Drug Options (FDO)-H.Jiang. JID 2003

• End point que usando los sistemas informáticos de
  interpretación de genotipos calcula las opciones
  terapéuticas futuras en base a las resistencias
  genotípicas acumuladas.
• Medida FDO1 Se evalua calculando el nº de
  clases de fármacos a los cuales el virus
  analizado es sensible (1 punto por clase),
  añadiendo una puntuación de 0,3 si la familia de
  fármacos a la que permanece sensible es la de
  ANTI o IPs. Valores posibles0,1, 1.3 2, 2.3,
  2.6, 3, 3.3, 3.6.
• Medida FDO2 Se determina mediante dos
  componentes. El nº de clases de fármacos que
  incluya al menos un fármaco a los que el paciente
  es sensible (igual que en FDO!) nº total de
  antirretrovirales efectivos dentro de cada clase
  donde ND es el total de fármacos activos/ Tnd que
  es el total de antirretrovirales en aquel momento
  disponibles.

35
Guías sobre la utilización de los estudios de
resistencias en la práctica clínica
Guias Primoinfección Infección crónica Fracaso terapeútic Mujer embaraza pediatría Prof Post-exp
IAS 2003 R R R R Ne Ne
DHHS 2002 C NR R A Ne Ne
Europeas 2004 R C R R R R
GESIDA/SEIMC R C R A R C
R Recomendado, NR No recom, Ne No especifica,
C Considerar, A mismas consideraciones que en
pobl adulta
36
Documento de consenso de GESIDA sobre la
utilización de los estudios de resistencias en la
práctica clínica

• Pacientes pretratados
• Primer fracaso R
• Segundo y tercer fracaso R
• gt3 fracasos C
• Embarazadas R

37
Métodos fenotípicos

• Definen si una cepa del VIH-1 es sensible o
  resistente a un determinado fármaco
  antirretroviral, en función de su capacidad de
  replicación ante distintas concentraciones del
  fármaco.
• El resultado que se obtiene se conoce como
  concentración inhibitoria del 50 o del 90 (IC50
  o IC90) y se compara con la requerida para
  inhibir una cepa de referencia de laboratorio WT
  (folds).

38
Tipos de pruebas de resistencias fenotípicas

• Clásicas requieren aislar el VIH, cuantificar el
  virus a partir de linfocitos de sangre
  periférica. Los aislados son cocultivados con
  celulas mononucleadas de donantes sanos y
  estimuladas en presencia de diluciones seriadas
  de fármaco.
• Generación de virus recombinantes, se generan
  quimeras virales que portan los genes de interés
  (la TI y la PR) del paciente, para determinar la
  sensibilidad a todos los TAR disponibles.
  Antivirogram (Virco).PhenoSense HIV (ViroLogic
  Inc).

39
Se amplifica la región de la TI o PR del virus
del paciente, se recombina con un clon viral
infectivo sin región de la TI y de la PR y se
cocultiva en presencia de diferentes
combinaciones De antirretrovirales.
40
Ventajas e inconvenientes de los métodos
fenotípicos recombinantes
VENTAJAS
INCONVENIENTES

• No detecta subpoblaciones virales que constituyan
  lt10-20 de la población total.
• Proporciona información de sensibilidad a
  fármacos individuales , no a combinaciones de TAR
• Los valores de IC50 que definen sensibilidad o
  resistencia no están bien definidos para cada
  fármaco.
• Disponible sólo en laboratorios comerciales.
• Elevado coste

• Mayor representatividad de las diferentes
  cuasiespecies.
• Mayor rapidez
• Posibilidad de estandarización
• Proporcionan una medida directa de la
  sensibilidad a los diferentes TARs
• Informa de las resistencias cruzadas

41
Fenotipo Virtual

• Los laboratorios Virco disponen de una amplia
  base de datos que reune información fenotípica y
  genotípica de gt30000 muestras.
• El fenotipo virtual es un sistema de
  interpretación del genotipo, basado en la
  susceptibilidad fenotípica de aislados virales
  similares al virus problema.
• El FV nos da la probabilidad de que nuestra
  variante sea sensible o resistente, es útil en
  determinados patrones complejos de mutaciones,
  pero en otros el grado de certidumbre es menor.

42
Virco- Puntos de Corte

• Puntos de corte (Cut-off) Concentración debajo
  de la cual el virus es considerado sensible y
  encima de la cual es considerado resistente
  (definida como incremento en número de veces la
  IC50 )
• Cut-off técnico basados en medidas repetidas
  realizadas en un mismo aislado viral de
  referencia (coeficiente de variación de la
  prueba)
• Cut-off biológico (BCO) Basado en la variaciones
  de muestras clínicas de pacientes naives al TAR,
  estableciendo una curva de Gauss y un rango de
  resistencia/susceptibilidad para cada fármaco. Se
  consideran resistentes aquellos virus cuya IC50
  se aleja más de dos DE de la media .

43
Page 1 SUMMARY REPORT
1
1
1
2
3
5
4
1. Resistance-associated mutations 2.
VirtualPhenotypeTM predicted Fold Change in
IC50 3. Cut-Offs 4. Resistance Analysis 5.
Reference to Additional Clinical Notes
44
CUTT-OFF Clínico CCO

• CUT-off clínico Basándose en la respuesta
  virológica al TAR de gt3150 pautas en 2761
  pacientes incluidos en ensayos clínicos, lab
  VIRCO ha desarrollado módelos de respuesta
  virológica, mediante analisis de regresión (en
  función del cambio en la IC50 basal definida por
  vircotype y otras variables CV y los TAR
  sensibles basalmente)
• Define los clinical Cutt-offs
• Inferior FC a partir de la cual la respuesta
  comienza a perderse
• Superior FC a partir de la cual la respuesta
  es prácticamente nula
• Son difíciles de determinar. No disponible para
  todos los antirretrovirales.

45
Cutt-Offs clinicos (CCO) identifican actividad
parcial
46
Identification of fold-change values above which
the virological response starts to decline
.
i.e. LPV/r
100
loss virological response
Intermediate fold-change
High fold-change
Baseline fold-change values
Inferior FC a partir de la cual la respuesta
comienza a perderse Superior FC a partir de
la cual la respuesta es prácticamente nula
47
Page 2 DETAILED REPORT
1
1
1
2
3
4
5
1. Identifica las mutaciones clave de
resistencia 2. Busca en la base de datos patrones
de mutaciones semejantes, Nºparejas
genotipo-fenotipo localizadas 3. Representación
gráfica del continuo de resistencia 4. Predicted
Fold change in IC50, y 95 IC 5. Cut-Off clínicos
o biológicos
48
vircoTYPE Clinical Cutoffs for PIs and Boosted
PIs
Virologic Response Virologic Response
Drug vircoTYPE predicted FC of wild type clinical isolates 20 reduction of wild type response 80 reduction of wild type response
IDV 0.7 0.8 2.2
IDV/r 0.7 4.1 21
NFV 0.9 1.0 1.5
SQV 0.6 0.7 1.0
SQV/r 0.6 1.1 12
APV 0.6 0.7 1.4
APV/r 0.6 0.9 6.5
LPV/r 0.8 10 62