Presentaci

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ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
Rocio Inga PeñaDpto. Bioquímica, Biol Mol
Farmacología
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Modificaciones Glicosilación, fosforilación,
adición de grupos prostéticos, etc
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Extracto crudo(mezcla de proteínas)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
8
(No Transcript)
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Marcadores de Peso Molecular
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DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA PROTEINA PROBLEMA
Inicio de corrida(donde inicia el gel separador)
Frente de corrida (línea donde termina el
colorante)
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DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA PROTEINA PROBLEMA
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REACTIVOS

• Acrilamida (C3H5NO) formación de polímeros
• Bisacrilamida (N,N- methylenebisacrylamide
  (C7H10N2O2) - cross-linking entre las cadenas
  de polímeros
• SDS saturación con cargas negativas
• APS y TEMED catalizadores de la reacción de
  polimerización
• DTT o ßME agentes denaturantes
• Azul de Bromofenol Permite la visualización de
  la corrida electroforética. Carga negativa por
  encima de pH 4.6.

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Tinción del Gel SDS-PAGE

• La tinción con Azul de Coomassie ( Coomassie
  Brilliant Blue) puede detectar una banda de hasta
  50 ng
• La tinción con plata incrementa la sensibilidad
  de detección ( 50 veces aprox)

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ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

• Separación por
• Punto isoeléctrico
• Tamaño

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Separación por Punto Isoeléctrico
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Punto isoelectrico diferentepero del mismo tamaño
Punto isoelectrico igual pero diferente tamaño
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Análisis de Proteínas Multiméricas
- Se puede determinar el número y tamaño de
subunidades mediante la electroforesis bajo
condiciones denaturantes

• Agentes denaturantes frecuentemente usados
• Dithiotreitol (DTT)- ß-mercaptoetanol (ßME)

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El Dithiothreitol (DTT) es un agente denaturante
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PRACTICA A REALIZAR

• ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN UNA
  DIMENSION
• CONDICIONES
• DENATURANTES (SDS, BME, alta temperatura)

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• Las muestras para analizar serán diferentes
  fracciones obtenidas durante la purificación de
  la Pirazinamidasa
• Extracto crudo
• Fracción con proteìna, sin actividad
• Fracción con proteìna, con actividad

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Dos tipos de tratamiento de muestras A)
Denaturación directa de las muestras

• Mezclar 25 uL de la fracción 15 uL de Loading
  Buffer (Buffer de carga)
• Hervir por 4 - 5 minutos
• Cargar 20-25 uL en el gel.

B) Precipitación previa a denaturación - Se
utilizará el protocolo de precipitación con
Etanol (33)
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Actividad enzimática Cantidad de Proteína
(Pirazinamidasa) (Bradford)