Lezione 2-3 13/X/06

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Lezione 2-3 13/X/06

• Cosa dobbiamo sapere

La doppia elica orientamento dei due filamenti
5-3 DNA pol i cromatidi da cosa sono
costituiti ? quale è il verso di trascrizione
della RNA pol II coding strand filamento
trascritto mRNA non è il
templato cDNA (DNA complementare al
messaggero) da distinguere dalla Coding
Sequence a volte confusa col cDNA La sequenza
codificante corrisponde all RNA messaggero
contiene i codoni che vengono tradotti
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Trascrizione e complemetarietà
In banca dati la sequenza di un gene è indicata
nel verso di trascrizione e corrisponde alla
coding sequence che è uguale al messaggero (salvo
T U) Le sequenze per convenzione si
scricvono sempre 53 salvo quando si mostra una
doppia elica in cui cè la complementare che è
antiparallela
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Trascrizione orientamento e verso
La sequenza coding non è il templato
S B A G L I A T O
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Quale strand è trascritto? che verso ha ?
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Rna polimerasi II
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DNA templato della trascrizione
Tutte le pol sintetizzani 5-3 su un templato
3- 5 antiparallelo
schema giusto
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Cosa è un Southern blot

• DNA digerito con enzimi di restrizione
• - trasferito su filtro
• Ibridato con una sonda marcata di DNA a doppio
  filamento
• denaturato o con singolo filamento
• Studio di mappe di restrizione genomiche per
  individuare i frammenti di restrizione che
  contengono una data porzione di DNA o un
  frammento di un gene,
• Studio di un gene a partire da un cDNA

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Gel BrEt x Southern
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Foto Southern
A Genomic P1 clone (0.3 ug) and B human genomic
DNA (10 ug) were digested with EcoRI (E), BamHI
(B), HindIII (H) and PstI (P). The digested
samples were separated on a 1 agarose TBE gel,
blotted and hybridized with a PEDF cDNA probe. A
1 kb ladder is given to show relative sizes of
the hybridizing bands. The figure shows
similarities in restriction pattern between the
genomic DNA and the P1 clone.
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Cosa si analizza con un Northern blot
La trascrizione cellulare
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Foto Northern (lattato deidrogenasi)
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Le sonde (probes)
Sonde a DNA doppio o singolo filamento anche ad
RNA
Plasmidi con promotore di trascrizione Sp6
Sonde clonate o amplificate
Sonde marcate (32 P) o fluorescenti
Southern o Northern tipi di sonde uguali Per
Northern uso di sequenze trascritte
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Dallespressione al genomae viceversa
Con le sonde dei cDNA al genoma (mappa
e regioni non trascritte)
Con le sonde genomiche ricerca di geni
Uso dei marcatori
Ricerche di tutte le sequenze trascritte come
marcatori
Da sequenze ripetute mappature cromosomiche
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Struttura e regolazione dei geni
Perché i geni sono regolati
Meccanismi di regolazione dei geni
Differenze tra procarioti ed eucarioti
Differenti strutture regolative analizzate con
geni reporter e utilizzate allinterno di
plasmidi e vettori per espressione
Dovete sapere come è strutturato un gene,
differenze tra procarioti ed eucarioti, geni
costitutivi e house keeping, geni inducibili,
regolati e tessuto specifici. (corso di bio
molec.)
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Che vuol dire clonare a che serve come si fa
I cloni in microbiologia o genetica dei
microoranismi
I colonia (clone) deriva dalle mitosi di una
singola cellula e contiene qualche centinaio di
migliaia di cellule
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Cloni di cellule eucariotiche
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Esperimenti olistici (? progr. euristici
autoincr.)
Phenotypic alteration of eukaryotic cells using
randomized libraries of artificial transcription
factors Nature Biotechnology 21, 1208 - 1214
(2003) Published online 7 September 2003
doi10.1038/nbt868 Kyung-Soon Park1, 2, Dong-ki
Lee1, 2, Horim Lee1, Yangsoon Lee1, Young-Soon
Jang1, Yong Ha Kim1, Hyo-Young Yang1, Sung-Il
Lee1, Wongi Seol1 Jin-Soo Kim1 Correspondence
should be addressed to Jin-Soo Kim
jsk_at_toolgen.com We have developed a method in
which randomized libraries of zinc
finger-containing artificial transcription
factors are used to induce phenotypic variations
in yeast and mammalian cells. By linking multiple
zinc-finger domains together, we constructed more
than 100,000 zinc-finger proteins with diverse
DNA-binding specificities and fused each of them
to either a transcription activation or
repression domain. The resulting transcriptional
regulatory proteins were expressed individually
in cells, and the transfected cells were screened
for various phenotypic changes, such as drug
resistance, thermotolerance or osmotolerance in
yeast, and differentiation in mammalian cells.
Genes associated with the selected phenotypes
were also identified. Our results show that
randomized libraries of artificial transcription
factors are useful tools for functional genomics
and phenotypic engineering.
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Clonaggio come manipolazione di DNA
Clonaggio plasmidi enzimi di restrizione
Clonaggio perché i cloni sono isogenici e se
contengono un plasmide si moltiplica con le
cellule
Le cellule trasfettate col plasmide si clonano
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Strategia e metodo di clonaggio
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Cloning a Gene into a Plasmid
Amplificazione tramite PCR
clonaggio
Gene codificante di interesse
Plasmide di espressione
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Growth and Purification of Plasmids
trasfezione
estrazione del DNA
crescita batterica col plasmide tramite selezione
Purificazione del plasmide
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Recombinant DNA Technology and Vaccine Development
produzione dellantigene In vitro
Cellule eucariotiche
vettore col vaccino
Produzione dellantigene in vivo