VARIASI GENETIK EMPAT VAR. PADI UNGGUL DENGAN ANALISIS RAPD MENGGUNAKAN 2 PRIMER OPR

1
VARIASI GENETIK EMPAT VAR. PADI UNGGUL DENGAN
ANALISIS RAPD MENGGUNAKAN 2 PRIMER OPR

• OLEH
• Panagal M., John B., Arun K., Ali A.
  DKK.
• Dept. BIOTEK. LINGK., Plant Science Univ.
  BHARATHIDASAN, TAMIL NADU, INDIA.
• Dept. BIOTEKNOLOGI, PERG. TINGGI Marudhu
  Pandiyar, TAMIL NADU, INDIA.
• Dept. Kimia, Univ. Nasional PUKYONG, BUSAN
  KOREA SELATAN.
• Sumber ARPN Journal Of Agricultural and
  Biological Science
• Vol. 5, No. 4, July 2010
• Dikaji kembali
• BAMBANG SURYOTOMO
• (Surakarta, 28 Juni 2013)
• (TUGAS BIOMOL REKAYASA GENETIKA)

2
RINGKASAN-1

1. Untuk mengetahui keanekaragaman Genetik 4
   Genotipe Padi (Oryza sativa ) digunakan Marker
   (Penanda) acak RAPD.
2. Genom DNA Padi (O. sativa ) diisolasi dari
   daunnya, dan dihitung menggunakan Spktrofotometer
   sinar UV serta diampliflikasi dgn menggunakan
   Primer OPR1 dan OPR2.
3. Dgn OPR1, Genom DNA 4 Genotipe Padi yg
   diamplifikasi, memberikan fragmen yang
   Non-Polymorfik (tidak dapat membedakan dari
   keempatnya).

3
RINGKASAN-2

• 4. Dgn OPR2, Genom DNA dari 4 Genotipe yg
  diam-plifikasi, menujukkan fragment yg
  Polymorfik. (dapat membedakan dari keempatnya).
• 5. Dgn menggunakan Software Jarak Genetik Neis
  (1978) dapat ditentukan variasi kekerabatan
  Genotipe padi yg diuji.
• 6. Kekerabatan Genotipe padi yg diuji secara
  berurutan adalah ADT38, ASD16, IR20 dan PONNI
  (Gb.4)
• 7. Dari hasil tsb dapat digunakan sebagai bahan
  pertim-bangan untuk menghasilkan Hibrida dgn
  Heterosis yang maksimum (yg diinginkan).

4
PENDAHULUAN-1

• Beras mrpk tan.penting di dunia, menyediakan
  banyak kalori. Saat ini 90 beras diproduksi dan
  dikonsumsi di Negara-2 Asia (Parantha-man et al.,
  2009).
• Di India, dalam tahun 2003-2004, 87 juta ton
  beras, yg dipro-duksi dari daerah 42,41 juta ton
  (James Martin, 2007).
• Permintaan beras diperkirakan pd thn 2010, 100
  juta ton dan akan meningkat menjadi 140 juta ton
  pd thn 2025 (Singh, 2004).
• Beras memp. Genom terkecil dr semua jenis cereal
  430 juta Nukleotida, dapat menjadi model genom
  tanaman berbunga

5
PENDAHULUAN-2

• Genotipe ADT 38
• Adaptip pada wil.dgn Irigasi yg tidak teratur
• Tahan thd embusan angin, tahan belalang, Gall
  midge, Daya hasil 58kw/ha
• 2. Genotipe ASD 16
• Toleran salinitas, cenderung tahan Wereng coklat,
  kutu busuk.
• Daya hasilnya 56 kw/ha

6
PENDAHULUAN-3

• 3. PONNI
• Tahan thd hama bakteri daun, Virus tungro,
  penggerek batang
• Daya hasil 45 kw/ha.
• 4. IR 20
• Tahan thd hama bakteri daun, Virus tungro,
  penggerek batang
• Daya hasil 45 kw/ha.

7
PENDAHULUAN-4

• Saat ini PCR (Polymeration Chain Reaction)
  berbasis RAPD (Randomly Amplified Polymor-phic
  DNA) lebih murah sederhana diban-dingkan RFLP
  (Retriction Fracment Length Polymorphism)
  (William et al., 1990).
• Keuntungan RAPD, sederhana, DNA sedikit, mampu
  meregenerasi polymorfisme.(Yu Ngu yen, 1994).
  Memp.Primer Universal, butuh primer sedikit unt.
  Identifikasi polymorfisme suatu Spesies. Krn itu
  penel. Ini dilakukan

8
Bahan dan Metoda-1

• Bahan Tanaman
• Empat Var. biji O. sativa yi, PONNI, ADT38, IR20,
  ASD 16,
• Diperoleh dari Bank-benih dr Univ. Pertanian ,
  India.
• Benih ditanam dalam pot pada kondisi
  laboratorium.
• 2. Isolasi Genom DNA
• Metode Isolasi menurut Sambrook et. Al., (1989)
  dgn sedikit modifikasi. Contoh daun tan. (0,5
  g/kg) digiling dgn 1 ml buffer yg homogen.
• 1 ml sample lysis kmd disentrifugasi pada
  kecep.8000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 C.
  Supernatan dipindahkan dalam tabung baru berukran
  1,5 ml dan dicampur dngn Fenol, Isoamyllalcohol
  disentrifugasi pada 1.000 rpm selama 10 Menit
  pada suhu 4

9
Bahan dan Metoda-2

• 3. Gel Elektrofrensis
• 15 µl DNA dicampur dgn Pewarna bermuatan (Genei,
  Bangalore), dan diloading pd 0.8 Gel Agarosa.
• Genomik DNA dielektroforensis pd 75 Volt selama 1
  jam, dan Amplifikasi PCR dilakukan selama 1-2 jam
  pd 55 Volt.
• Gel diwarnai dgn Etidium Bromida dan disinari
  dengan UV untuk visualisasinya (Bend2nya)

10
Bahan dan Metoda-3

• 4. Penghitungan DNA dgn Spektrofotometer UV
• Sampel DNA yg diisolasi diukur dgn
  Spektrofotometer sinar tampak UV. Dgn absorbansi
  pada 260-280 nm, maka Konsentrasi DNA dapat
  ditentukan.
• Konsentrasi DNA OD260 x 50 µg/ml x faktor
  pengenceran.
• 5. Primer
• Primer Acak disintesis di Genei Bangalore.
• Panjang masing2 Primer 10 bp (pasang basa), dgn
  urutan sequen sbb

Primer Sequence
OPR1 GCACCGATCT
OPR2 GATTCCGCGG
11
Bahan dan Metode-4

• 6. Reaksi RAPD-PCR
• Reaksi amplifikasi dilakukan men. Saker et al.
  (2005) dgn sedikit modifikasi, yg berisi Template
  (1.5 µl), Primer (1 µl), Campuran Enzim induk
  (12,5 ml) dan Air Milli Q (10 ml).
• Amplifikasi dilakukan pd siklus termal DNA pd
  profile PCR Pre denaturasi pd 94C selama 5
  menit, 36 siklus pd 94C selama 30 dtik, 36C
  selam 30 dtk dan 72C selama 1 menit dan akhir
  ekstensi pd 72C selama 5 menit, produk akhirnya
  diamplifikasi pd 4C.
• 15 µl produk (DNA) diamplifikasi pd 2 Gel
  Agarosa dgn Ethidum Bromida. Elektroforensis
  tampak pd sinar UV

12
Bahan dan Metoda-5

• 7. Analisis Data
• Analisis dilakukan dgn membandingkan Pola RAPD
  setiap individu Genom DNA sempel.
• Fragmen yg memberikan marker jelas/kuat untuk
  setiap individu diberi skor shg muncul pd grafik
  data.
• Pola pita Gen dievaluasi berdasarkan Jarak
  Genetik Neis (1978) dgn Program Free-Tree-Free
  (Pavlicek et al., 1999).
• Pohon Filogenetic dibuat dengan bantuan Software

13
Hasil dan Pembahasan-1

1. Genom DNA padi yg diisolasi dan diuji dg.
   Elelektroforensis, menghasilkan pita yang beragam
   dgn konsentrasi 3,8-93 ng.(Gbr. 1).
2. Dgn Primer OPR1 Genom 4 Var yg diuji menghslkan
   27 pita yg memp. 300-1600 ps basa (bp),Primer tsb
   Tidak Bisa membedakan genom ke-4 Var. Padi yg
   diuji (dgn Primer OPR1 Amplifikasi Genon DNA Padi
   yg diuji, menunjukkan Non Polymorphic, pola pita
   identik, gbr. 2).

14
Hasil dan Pembahasan - 2

• 3. Dgn Primer OPR2, hsilnya lebih informatif
  di-banding Primer OPR1, artinya dgn Primer OPR2
  dapat menunjukkan Pola pita yg ber-beda dari 4
  Var. Genom padi yg diuji. (gb.3).
• 4. Analisis RAPD dgn Primer OPR2 yg memp.
  sequence GATTCCGCGG dpt digunakan untuk
  membedakan pola pita genom DNA padi yg diuji dan
  menganalisis hub. kekerabatan (dgn menggunakan
  Dendrogram UPGMA, Gb. 4).

15
Ilustrasi PCR berbasis RAPD
16
Ilustrasi Genomic DNA
17
Hasil Analisa Elektroforensis GENOM DNA Padi
(Oryza sativa) yg diuji (Gb. 1)

• ADT38 89 ng
• ASD16 100 ng
• PONNI 88.3 ng
• IR20 93 ng

18
Amplifikasi dgn OPR-1 (Non Polymorfic) (Gb.2)

• Amplifikasi dgn OPR1 tdk bisa membedakn antar
  Genom DNA
• M 1 Kb DNA Ladder
• ADT38
• ASD16
• IR20
• PONNI

19
Amplifikasi dgn OPR-2 (Polymorfic) (Gb.3)

• Dgn Primer OPR2, dpt membedakan antar Genotipe
  Padi
• M 100 bp DNA Ladder
• ADT38
• 2 ASD16
• 3 IR20
• 4 PONNI

20
HUBUNGAN KEKERABATAN BERDSRKAN JARAK GENETIK 4
GENOTIPE PADI (Oryza sativa) (Gb.4)

• Gb. 4. Dendrogram UPGMA Neis(1978), mengukur
  jarak genetic diantara 4 sampel O. sativa hasil
  analisis RAPD

21
Hubungan kekerabatan (jarak genetic) populasi
EMPAT GENOTIPE. Padi (Oryza sativa ), tampak
berbeda diukur berdasar Jarak genetic Neis
(1978). 
PONNI IR20 ADT38 ASD16
PONNI 0.39138 1.77767 1.02564
IR20 0.39138 1.60944 1.95601
ADT38 1.77767 1.60944
ASD16 1.02564 1.95601 0.8574
22
KESIMPULAN-1

1. Dgn analisis PCR berbasis RAPD dpt menduga
   keragaman dan hubungan genetik antar spesies dari
   Oryza sativa
2. Dgn dua Primer (OPR1 OPR2) dpt me-ngungkap
   keragaman genetic Genotipa Padi (Oryza sativa ).
3. Urutan keragaman genetik padi yg diteliti adl
   ADT38, ASD16, IR20 dan PONNI. (dari pohon
   Filogenik)

23
KESIMPULAN-2

• 4. Jarak genetik terjauh terdapat antara
  Genoti-pa ASD16 dgn IR20 (1.95601).
• 5. Jarak genetik terdekat terdpt pada Genotipa
  PONNI dgn IR20 (0.39138).
• 6. Analisis dgn PCR berbasis RAPD merupakan
  penelitian yg murah dan terbaik mengetahui
  keragaman Genetik Spesies baru.

24
PENUTUP

• Pertanyaan
• Mengapa data fenotipe (daya hasil, tingkat
  serangan) tidak disertakan dalam analisis?
  Mungkin hasil lebih memp. Arti bagi Breeder.
• Genotipe Uji yg digunakan sedikit, kalau genotipe
  ditambah, mungkinkah Primer OPR1 yg digunakan
  dapat Polymorfis?.
• Wassalamualaikum Wr. Wb.