Pesquisas em genoma funcional

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Pesquisas em genoma funcional
Revolução da pesquisa na área de ciências
biológicas
Quando?
Década de 90
Porque?
Universalização e desenvolvimento das técnicas de
DNA recombinante
- Barateamento do preço dos sequenciamento
Desenvolvimento de novas tecnologias para
sequenciar DNA e proteinas
- O genoma de 45 microorganismos já foram
sequenciados
Fatos
- O genoma de duas plantas completamente
sequenciado
- Genoma de Drosophila completamente sequenciado
- Genoma do camundongo completamente sequenciado
- Sequenciamento do genoma humano proximo de seu
termino
Grande numero de programas de sequenciamento
aleatorio de sequencias (EST) Expressas está em
andamento em vários diferentes organismos e
espécies
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Consequências atuais
- Grande quantidade de informação disponível
- Formação de grandes consórcios de pesquisa
Projeto 2010
- Análise científica mais holística
Consequências futuras
- Predição dos fenótipos que resultariam de
mudancas genéticas específicas
- Identificar quais mudanças genéticas poderiam
acelerar a domesticação de espécies selvagens
Facilitar a manipulacao genética que garantiria a
manutenção e expansão das bases de germoplasma
Descrição dos mecanismos responsáveis pela
heterose habilidade de utilizar este fenômeno
mais efetivamente
Melhor compreensão da base genética da
plasticidade fenotípica
Caracterização do grupo mínimo de genes para o
funcionamento de um organismo
Compreensão da base genética da evolução
melhor compreensão da diversidade da vida na terra
Compreensão das interações entre os organismos e
seu ambiente a nível de ecosistema
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Estratégia de Genoma funcional Ex tolerância a
estresses abióticos
Homologia como critério para identificar genes
em bancos de sequências EST e genômicas
EMS, radiação, T-DNA, transposons
cDNA macro/microarrays genechips
Criação e análise de um banco de dados
Sistema duplo-hibrido de leveduras
Complementação leved.
Phage display
Mutante em Arabidopsis
Interação in vitro (crom. Afinidade,
imunoprecipitação
Superexpressão
Alelismo
Aditividade
Antisenso.
Epistasia
Supressão por RNAi
Fusão proteína com GFP
Supressão
Expressão GFP ou luciferina com o promotor
Construção de modelos de controle dos processos
envolvidos
Modificação de plantas de interesse agrícola
baseados nesses modelos modificação
simultânea da expressão de vários genes
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(No Transcript)
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Transcriptoma
Análise dos níveis de RNA de varios genes
simultaneamente
Um genoma possui varios transcriptomas
varios transcriptomas temporais
Ex tempo apos sujeicao a um estresse
Ex tempo apos uma determinada fase do
desenvolvimento
varios transcriptomas espaciais
Ex transcriptoma celular-especifico
Ex transcriptoma tecido-especifico
Ex transcriptoma orgao-especifico
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Etapas para a realizacao de um transcriptoma
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1) Filme Macroarray.mov
2) Filme oligochip.mov
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(No Transcript)
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1a Etapa de um transcriptoma
Isolamento de DNA do banco de cDNA
Preparacao do Micro/Macroarranjo (Micro/macroarray
)
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2a Etapa de um transcriptoma produção da sonda
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2a Etapa de um transcriptoma hibridação
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3a Etapa de um transcriptoma obtenção e análise
da imagem
Gene com reduzida expressão na presença do
estresse
Gene expressão acentuada na presença do estresse

• Nível de expressão na presença do estresse
• x
• y (ygtx)
• -z

Genes sem alteração na expressão
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3a Etapa de um transcriptoma obtenção e análise
da imagem
1
5
1
2
3
4
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Exemplo de data mining
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Exemplos de análise dos dados de um transcriptoma
Análise de agrupamento da expressão de fatores
transcripcionais na resposta a diferentes
estresses ambientais em Arabidopsis
Comparação dos transcriptomas na presença de
dois diferentes estresses
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Análise de Grupos 2 genótipos
Genótipo sensível ao estresse salino IR29
(direita)
Genótipo tolerante ao estresse salino Pokkali
(esquerda)
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Comparação de diferentes transcriptomas temporais
durante um processo celular
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Diferentes Transcriptomas de genes que responde
a estresses abióticos
Classe 1 genes da rota de transdução de sinal à
estresses abióticos associada ao f
ator transcripcional DREB1A
Classe 2 genes da rota de transdução de sinal à
estresses abióticos independente do f
ator transcripcional DREB1A
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Confirmação dos resultados do transcriptoma
análise por Northern Blot
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Classes de genes afetadas pelo estresse salino
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Análise de grupos Transcriptomas da resposta a
patógeno
DNA alvo fatores transcricionais do genoma de
Arabidopsis
Sonda 1e 2 Mutantes na síntese de ácido
salicílico
Sonda 3 Mutantes na síntese de ácido jasmônico
Sonda 4 Mutantes na síntese do etileno
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Kits completos com microarranjos com
oligonucleotideos e sonda de referencias
oligonucleotideos escolhidos baseados em regioes
com baixa homologia a outros genes
Vantagens
- estringencias das pos-lavagens pode ser maior
menor nivel de hibridizacao cruzada
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Transcriptome changes for Arabidopsis in response
to salt, osmotic and cold stress
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Maioria das mudanças são estimulo-específicas
sob. De 5 e 0,5 (3-27h)
200 mM Manitol100 mM NaClÇ 40 sobreposição foi
observada em folhas (sem contato)
Frio alterou 2 vezes mais a expressão gênica do
que os outros estresses Mais induzido gene ELIP
liga a chl a
Maioria das sobreposições foram específicas à
folhas ou raízes
Sobreposições podem ser perdidas em experimento
que examina um limitado número de pontos
temporais ou ignora as diferenças
tecido-específicas
3 -gt 27h redução em 4 vezes nas respostas
comuns respostas mais específicas a cada
estresse se seguem após o choque inicial
Transcriptoma do estresse ao frio movimento para
um novo e diferente steady-state
Raízes e folhas apresentam diferentes
modificações no seu transcriptoma para cada
estresse ExÇ 86 das mudanças induzidas pelo
frio não são compartilhadas entre folhas e raízes
Estresses regula a expressão de mais de 370 genes
cuja função é totalmente desconhecidaÇ Pistas
especificidade de tecido e regulação por
múltiplos estresses CBF1 e ABA2 sim folha, não
raiz

• Maioria 2409 genes reg. pelo estresse não tem
  seq tipicas dos fat. transc. CBF1 e DREB1
• Presença de outros elementos importantes nas
  sequências dos promotores
• Um grande número de mudanças podem ser causadas
  por diferenças na estabilidade do RNA ao invés da
  reg transc.

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(No Transcript)
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Identificacao de genotipos tolerantes e
susceptiveis
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Sugestao de proposta para elaboracao de projeto
genoma funcional na UFV 1) transcriptoma
Realizado na UFV
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Múltiplas repetições teste de repetibilidade
anãlise estatística seq. diferentes
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(No Transcript)