CELIJSKE KULTURE

1
CELIJSKE KULTURE
2
ŠTA JE CELIJSKA KULTURA ?
KULTURA ORGANA, KULTURA TKIVA održavanje celih
organa ili fragmenata tkiva u in vitro uslovima,
uz ocuvanje meducelijskih veza kakve postoje in
vivo.
KULTURA CELIJA održavanje odredenog tipa celija
izolovanih iz odgovarajuceg organa/tkiva u in
vitro uslovima.
3
ZAŠTO GAJITI CELIJE U KULTURI ?

• Ispitivanje normalne celijske fiziologije i
  biohemije Npr. ispitivanje metabolickih puteva
  pracenjem produkata razgradnje radioaktivno
  obeležene supstance

• Testiranje efekata razlicitih jedinjenja na
  odredeni tip celija
• Npr. metaboliti, faktori rasta, hormoni,
  potencijalno toksicne ili mutagene supstance,
  lekovi ...

• Produkcija veštackog tkiva kombinovanjem
  specificnih tipova celija
• Npr. potencijalno znacajan nacin za formiranje
  veštacke kože u tretmanu opekotina

4
ZAŠTO GAJITI CELIJE U KULTURI ?

• Sinteza korisnih, komercijalno znacajnih
  bioloških produkata
• Npr. Proteini koji su in vivo u celiji prisutni u
  minimalnim kolicinama, mogu se gajenjem celija in
  vitro proizvesti u kolicinama koje se mere
  gramima, pa i kilogramima (primena u
  biotehnologiji)

5
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA
CELIJSKU KULTURU ?

• STERILNI USLOVI

• LAMINAR (hood, biosafety flow cabinet)

6
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA
CELIJSKU KULTURU ?

• INKUBATOR - održavanje esencijalnih parametara
  na nivoima optimalnim za ocuvanje celijske
  kulture i vijabilnost celija
• temperatura - obicno 37?C za sisarske celije
• vlažnost vazduha sprecava isparavanje medijuma
• CO2 najcešce 5, održavanje pH medijuma

7
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA
CELIJSKU KULTURU ?

• POSUDE ZA GAJENJE CELIJA U KULTURI

Flaskovi najcešce polistirenski, sa površinom
adaptiranom za prijanjanje i rast celija
Petri ploce
8
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA
CELIJSKU KULTURU ?
Mikrotirar ploce (multi-well plates) 96-, 48-,
12-, 6 well ploce
9
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA
CELIJSKU KULTURU ?
Spinner bottles/flasks staklene boce, sa
centralnom teflonskom drškom sa magnetom gajenje
celija u suspenziji
Roller bottles plasticne boce celije
prijanjaju za celu unutrašnju površinu
10
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA
CELIJSKU KULTURU ?
Cell factory
11
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA
CELIJSKU KULTURU ?

• MIKROSKOPI

Standardni
Inverzni
12
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA
CELIJSKU KULTURU ?

• CENTRIFUGE

• KONTEJNERI SA TECNIM AZOTOM

13
KAKO SE DOBIJAJU CELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?

• PRIMARNA CELIJSKA KULTURA

celije se izoluju direktno iz životinje, i gaje u
medijumu
mehanicka izolacija izvodi se presovanjem tkiva
kroz filtere, procedura brza, ali visok stepen
mehanickog oštecenja celija ? enzimatska
disagregacija tkiva do pojedinacnih celija
koriste se proteoliticki enzimi, npr. tripsin ili
kolagenaza
14
KAKO SE DOBIJAJU CELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?
U zavisnosti od organa iz kog se celije izoluju,
primenjuju se razlicite eksperimentalne
procedure - perfuzija organa rastvorom
enzima - inkubacija delova organa/tkiva u
rastvoru enzima
VAŽNO! Obezbediti što kraci kontakt tkiva i
proteolitickog enzima! Tripsin 10-20 min duže
izlaganje može da izazove oštecenje
membrane Kolagenaza manje destruktivna na nivou
celijske membrane, ali takode zahteva brzo
uklanjanje iz sistema
15
KAKO SE DOBIJAJU CELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?
Po završetku inkubacionog vremena/perfuzije,
reakcija se prekida dodavanjem hladnog medijuma !
disagregacija tkiva i resuspendovanje celija
praceno uklanjanjem proteolitickog enzima iz
sistema brojnim ispiranjima i centrifugiranjem
celija
KRAJNJI CILJ 1. dobijanje što cistijeg
preparata, tj. sa što manjim brojem drugih celija
koje su sastavni deo tkiva iz kog se vrši
izolacija - tokom izolacije centrifugiranjem
na gradijentu, - selektivnim gajenjem postiže
se odgovarajucim sastavom medijuma 2.
zadovoljavajuca vijabilnost celija
16
KAKO SE DOBIJAJU CELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?
Nakon izolacije, odreduje se broj celija u
dobijenoj suspenziji, i pravi se suspenzija iz
koje se celije sade u odgovarajuce ploce.
Potreban period za oporavak celija od izolacije i
prijanjanje za podlogu, (2-24h) ! Tek nakon toga
radi se tretman celija i sl...
Primarne celijske kulture imaju ogranicen životni
vek (meri se danima/nedeljama)
17
KAKO SE DOBIJAJU CELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?

• KONTINUALNA CELIJSKA KULTURA

Celije sa neogranicenim kapacitetom
proliferacije, tzv. besmrtne celije !
KAKO NASTAJU KONTINUALNE CELIJSKE LINIJE?
1. Transformacijom celija in vitro
Razlicite tehnike tretman celija mutagenima,
virusima ili onkogenima infekcija retrovirusima
2. Od tumorskih celija kancerogeneza in vivo
Npr. HeLa celije tumora grlica materice, Namalwa
celije tumora limfnih žlezda i dr.
18
KAKO SE DOBIJAJU CELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?
KOLEKCIJE CELIJSKIH KULTURA
Banke celija veliki izbor dobro
okarakterisanih celijskih linija
Suspenzija željenih celija se doprema poruciocu u
zamrznutom stanju (na suvom ledu) po pristizanju
u laboratoriju, celije se odmrzavaju i pocinje
kultivacija
Uz celije, dobija se i katalog sa svim potrebnim
informacijama vezanim za uslove gajenja i
istoriju date celijske linije
19
KAKO SE DOBIJAJU CELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?
Najvece i najpoznatije kolekcije, sa preko 3000
dobro okarakterisanih celijskih linija
The American Type Culture Collection (ATCC),
USA www.atcc.org The European Collection of
Animal Cell Culture (EACC), UK www.ecacc.org
20
KAKO ODRŽAVATI CELIJE U KULTURI ?

• MEDIJUM

Kompleksan rastvor, sadrži razlicite komponente
potrebne za normalan rast i metabolicku aktivnost
celija.
Vrsta medijuma koja se koristi specificno za
svaku celijsku liniju
Tecni medijumi (kupuje se napravljen, sterilan
rastvor i kao takav se koristi)
21
KAKO ODRŽAVATI CELIJE U KULTURI ?
Medijumi u prahu - prema odgovarajucoj
recepturi, pravi se rastvor, podešava pH, i
obavezno se steriliše filtriranjem kroz filter sa
porama velicine 0.22µm.
22
KAKO ODRŽAVATI CELIJE U KULTURI ?
STANDARDNE KOMPONENTE MEDIJUMA

• Ugljeni hidrati najcešce glukoza kao osnovni
  izvor energije riboza kao prekursor za sintezu
  nukleinskih kiselina fruktoza

• Aminokiseline 0.1-0.2mM, kao prekursori za
  sintezu proteina Glutamin 2-4mM, prekursor
  intermedijera u TCA ciklusu

• Soli izotonicnost rastvora

• Vitamini i hormoni u malim koncentracijama
  (µmol), kao metabolicki ko-faktori udeo i vrsta
  izuzetno variraju u zavisnosti od vrste medijuma
  tako da odgovaraju zahtevima celijskih linija za
  koje se dati medijum koristi

23
KAKO ODRŽAVATI CELIJE U KULTURI ?

• Supstance za održavanje pH rastvora
• Bikarbonati (NaHCO3) u kombinaciji sa CO2 u
  atmosferi (5-10), omogucuje se održavanje pH na
  6.9-7.4. Nedostatak po vadenju iz inkubatora, pH
  može naglo da poraste
• HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfoni
  c acid ) 10-20mM može da spreci porast pH
  celije mogu da se gaje i u atmosferi bez CO2

• Phenol red indikator pH, osetljiv na vrlo male
  promene pH (okvirno pH 6.5- žut, pH 7.0
  narandžast, pH 7.4 crven, pH 7.8 ljubicast
  medijum), postoje i formulacije bez ove
  komponente (takvi medijumi su bezbojni rastvori)

24
KAKO ODRŽAVATI CELIJE U KULTURI ?
DODACI MEDIJUMU

• Serum sadrži faktore rasta, neophodne za bolji
  rast i proliferaciju celija u kulturi

Najcešce se koriste fetalni teleci (fetal
calf/bovine serum FCS, FBS) ili konjski serum
(fetal horse serum), zbog vrlo visokog sadržaja
embrionalnih faktora rasta, zatim teleci serum
dobijen od životinje stare 10 dana (newborn calf
serum), teleci serum dobijen od životinje stare
manje od 8 meseci (donor calf serum).

• Udeo u medijumu najcešce 10 ili 5
• kupuje se kao sterilan, testiran na prisustvo
  mikroorganizama i nekih hemijskih jedinjenja

25
KAKO ODRŽAVATI CELIJE U KULTURI ?

• Antibiotici smanjuju rizik od kontaminacije

Penicilin ( 100 IU/ml) inhibira rast Gram
bakterija Streptomicin ( 50-100 mg/l) inhibira
rast Gram i Gram- bakterija Amfotericin (25
mg/l) antifungalni agens
26
KAKO ODRŽAVATI CELIJE U KULTURI ?

• PRACENJE CELIJSKE KULTURE

ODREÐIVANJE BROJA CELIJA
U radu sa primarnim kulturama odredivanje broja
izolovanih celija, odredivanje vijabilnosti
celija pravljenje suspenzije za sadenje sa
odgovarajucim brojem celija,...
U radu sa kontinualnim kulturama pracenje rasta
i proliferacije celija, pasažiranje celija,
pravljenje suspenzije za sadenje sa odgovarajucim
brojem celija, ...
27
Trypan Blue Exclusion Test TBE Test
Neuber-ova komora
suspenzija celija trypan blue (R)
Brojanje celija u A-kvadratima Neuber-ove komore
Žive celije neobojene Mrtve celije - obojene
plavo
28
KAKO ODRŽAVATI CELIJE U KULTURI ?
KONTINUALNE LINIJE PASAŽIRANJE CELIJA
U zavisnosti od dinamike rasta celija i broja
celija koji se pasažira, pasažiranje se obicno
radi jednom nedeljno.
Obavezna zamena medijuma svežim, svaka 2-3 dana !
29
KAKO ODRŽAVATI CELIJE U KULTURI ?
PROBLEM KONTAMINACIJA
Vreme za koje se udvostruci broj celija
sisarske celije 24h bakterijske celije
30min
- prepoznaje se po promeni boje i/ili zamucenju
medijuma
- bakterije, plesni, mikoplazma
ŠTA URADITI ?
- Kontaminirane kulture što pre ukloniti iz
laboratorije, da kontaminacija ne zahvati zdrave
linije
- U pojedinim slucajevima (npr. pri kontaminaciji
mikoplazmom) moguce je lecenje kulture
odgovarajucom kombinacijom antibiotika
- Identifikacija i eliminacija izvora
kontaminacije
30
PREDNOSTI I NEDOSTACI

homogenost nakon izvesnog vremena u kulturi menjaju se karakteristike celija (promene u enzimskoj aktivnosti, favorizovano preživljavanje celija koje brže rastu...)
konzistentnost i reproducibilnost rezultata teškoce u postavljanju idealnih uslova za opstanak i rast celija
mogucnost proucavanja direktnih efekata na celijskoj populaciji
posebno pogodan model u toksikološkim istraživanjima (efekat pojedinih jedinjenja na specifican tip celija niska cena testova toksicnosti u odnosu na eksperimente in vivo)
broj parametara koji uticu na ispitivani proces sveden na minimum
iskljucen uticaj drugih organa, cirkulatornog i imunog sistema
31
VAŽNO! Ovo su bile neke osnovne informacije o
radu sa celijskim kulturama. Potrebno je stalno
imati na umu da je svaka celijska linija prica za
sebe, sa svojim posebnim zahtevima i
specificnostima, koje je potrebno dobro
upoznati i prouciti kako bi gajenje u kulturi
bilo uspešno.