Alu-TPA PCR Kit

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PraktikumNachweis einer gentechnischen
Veränderung in Lebensmitteln durch PCR
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Vorbereitung Lehrer
Für jede Arbeitsgruppe werden 550 µl
InstaGene-Matrix aliquotiert! Das Tube wird mit
IGbeschriftet!
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DNA-Extraktion

• 1. Vorbereitung
• 1.1 Beschriften Sie 2 Schraub- tubes mit
• - non GMO (-GMO)
• - Lebensmittelprobe (T)und Ihrer
  Gruppennummer!

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DNA-Extraktion

• 1.2 Pipettieren Sie jeweils 250 µl der durch Auf-
  und Abpipettieren homogenisierten
  InstaGene-Matrix aus Ihrem Vorratstube (IG mit
  550 µl Gesamtvolumen) in die beiden beschrifteten
  Tubes!

Überstand
Beide Tubes sollten etwa die gleiche Menge
InstaGene-Perlen enthalten!
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DNA-Extraktion
2. DNA-Extraktion aus nicht GV- Lebensmitteln
(-GMO)

• 2.1 Wiegen Sie 1 g des nicht gen- technisch
  veränderten Lebens- mittels (-GMO) ab und geben
  Sie es in einen Mörser!
• 2.2 Pipettieren Sie 5 ml H2Odest. hinzu!

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DNA-Extraktion
2.3 Homogenisieren Sie das Gemisch etwa 5
Minuten! 2.4 Pipettieren Sie weitere 5 ml
H2Odest. hinzu und zermörsern Sie weiter, bis
ein pipettierbarer Brei entstanden ist!
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DNA-Extraktion

• 2.5 Pipettieren Sie 25 µl des Lebens- mittelbreis
  in das mit -GMO beschriftete Schraubtube
  (Inhalt des Schraubtubes 250 µl InstaGene)!
• 2.6 Verschließen Sie das Tube und durchmischen
  Sie durch Anschnippen!

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• Um Kontamination mit GMO-DNA zu vermeiden, wurde
  zuerst das -GMO-Material extrahiert!
• Die Reinigung von Mörser und Pistill erfolgt mit
  einem Detergenz z.B. Pril. Danach wird mit
  H2Odest. nachgespült.

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3. DNA-Extraktion aus zu testendem Lebensmittel
(T)

1. DNA-Extraktion

• 3.1 Wiegen Sie 1 g des zu testenden
  Lebensmittels (T) ab und geben Sie es in einen
  Mörser!
• 3.2 Pipettieren Sie 5 ml H2Odest. hinzu!

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DNA-Extraktion

• 3.3 Homogenisieren Sie das Gemisch etwa 5
  Minuten!
• 3.4 Pipettieren Sie weitere 5 ml H2Odest. hinzu
  und zermörsern Sie weiter, bis ein
  pipettierbarer Brei entstanden ist!

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DNA-Extraktion

• 3.5 Pipettieren Sie 25 µl des Lebensmittelbreis
  in das mit ("T") beschriftete Schraubtube
  (dieses enthält bereits 250 µl InstaGene)!
• 3.6 Verschließen Sie das Tube und durch- mischen
  Sie durch Anschnippen!

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Reinigen Sie den Mörser und Pistill mit einem
Detergenz!
Reinigung
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4. Enzymdenaturierung bei 95C

1. DNA-Extraktion

• 4.1 Inkubieren Sie die beiden Schraubtubes 5
  Minuten bei 95C im Wasserbad!
• 4.2 Zentrifugieren Sie die Tubes 5 Minuten bei
  13000 Umdrehungen pro Minute!

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• Beachten Sie Bei der Entnahme der Kontroll-DNA
  (-GMO) und der DNA der Lebensmittelproben (T)
  aus den Schraubtubes darf nur der
  Überstand ohne InstaGene- Perlen
  entnommen werden!

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Bedeutung der InstaGene-Matrix

• InstaGene-Matrix ist negativ geladen ? bindet
  vorhandene Kationen ? Kationen dienen als
  Cofaktoren von Enzymen, wie z. B. der DNasen
• ? DNasen werden nicht aktiviert? DNA-Abbau wird
  verhindert

Aber InstaGene-Matrix bindet Mg2-Ionen und
hemmt damit die Polymerase bei der PCR
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Aufbewahrung der Proben
Die Tubes können im Kühlschrank (bei 8oC mit der
Matrix) über Tage aufbewahrt werden!
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Entnahme des Überstandes

1. DNA-Extraktion

• 4.3 Überführen Sie jeweils 50 µl des
  Überstandes aus Ihren Tubes in zwei neue,
  zuvor entsprechend beschriftete Tubes (GMO, T)!

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Ansetzen des PCR-Master-Mix
Zu beachten ist

• Gebrauchsfertiges Gemisch aus PCR-Master-Mix mit
  Primern darf bis zum Start der PCR nicht länger
  als 30 Min. auf Eis stehen!
• Innerhalb dieser 30 Min. müssen alle Proben für
  die PCR angesetzt sein!
• Eis richten!

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Achtung!!!

• Nach dem Auftauen
• der Taq-Polymerase
• und des Master Mix
• die Tubes vor dem Öffnen zentrifugieren!

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Zusammensetzung PCR-Master-Mix

• 100 mM KCl
• 20 mM Tris-HCl
• 2 mM dNTP (ATP, GTP, CTP, TTP)
• 4 mM MgCl2
• 1 µM Primer
• 0.35 µl Taq-Polymerase

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Ansetzen des Molekulargewichts-Standards durch
den Lehrer

• Pipettieren Sie 30 µl Orange-D-Loading-Dye zum
  Molekulargewichts-Standard!
• Tube auf Eis stellen!

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Aliquotieren des PCR-Master-Mixdurch den Lehrer

• Jeweils 300 µl PCR-Master-Mix werden zu den Plant
  Primern (6 µl)
• und
• GMO Primern (6 µl) pipettiert!
• Tubes auf Eis stellen!

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Vorbereitung PCR und Elektrophorese in
Gruppenarbeit (20)

• Jede Arbeitsgruppe bereitet für alle weiteren
  Gruppen entsprechend Ihrem Arbeitsauftrag einen
  Teil der PCR oder der Elektrophorese vor.

Arbeits- aufträge
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Tubes pro Arbeitsgruppe nach der Gruppenarbeit
-GVL
T
LD MWR
GVO
PMM
GMM
6 PCR-Tubes
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Ansetzen und Durchführung der PCR (200)

• Nummerierung der PCR-Tubes
• 1.1 Nummerieren Sie Ihre PCR-Tubes 1 - 6!

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1.2 Pipettieren Sie die PCR-Ansätze nach
folgender Tabelle!
Nr. Master Mix DNA
1 2 10 µl PMM 10 µl GMM 10 µl GVL (Kontrolle) 10 µl GVL (Kontrolle)
3 4 10 µl PMM 10 µl GMM 10 µl Lebensmittelprobe (T) 10 µl Lebensmittelprobe (T)
5 6 10 µl PMM 10 µl GMM 10 µl GVL (Kontrolle) 10 µl GVL (Kontrolle)
MM Mastermix GVL gentechnisch verändertes
Lebensmittel
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1. Ansetzen und Durchführung der PCR

• 1.3 Durchmischen Sie ihre PCR-Ansätze durch
  Auf- und Abpipettieren!
• Zentrifugieren Sie Ihre PCR-Ansätze falls
  notwendig 1 Minute bei 1000 Umdrehungen!
• 1.4 Kühlen Sie Ihre PCR-Ansätze im Eis bis zum
  Beginn der PCR!

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1. Ansetzen und Durchführung der PCR

- Um Verwechslungen zu vermeiden tragen Sie die
Position Ihrer Proben im Thermocycler auf dem
Übersichtsblatt ein!
Über-sichts-blatt
- Tubes müssen gut verschlossen sein!
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2. Durchführung der PCR

1. Ansetzen und Durchführung der PCR

• Führen Sie die PCR entsprechend dem
  Temperaturprogramm am Thermocycler durch!

Cycler-Programm
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DNA-Amplifikation

• Cycler-Programmierung

40 Zyklen
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Durchführen der PCR

• Cycler-Programmierung
• Denaturieren 94 oC 2 Min.
• 40 Zyklen
• Denaturieren 94 oC 1 Min.
  Primeranlagerung 59 oC 1 Min.
• DNA-Neusynthese 72 oC 2 Min.
• Vervollständigung der neuen Stränge
• 72 oC 10 Min.

Dauer ca. 3 Stunden
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Nach der Amplifizierung können die Proben bei
20oC im Eisfachoder über Nacht bei 4oC im Cycler
bis zur Gelelektrophorese aufbewahrt werden.
Ende der PCR
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1. Nachweis der PCRProdukte durch Elektrophorese
   (Agarose/PAGE)

1. Führen Sie den Nachweis der PCR-Produkte
   entsprechend Ihres Arbeitsauftrages als Agarose-
   oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch!
2. Färben Sie Ihre Gele entsprechend Ihres
   Arbeits-auftrages und werten Sie diese
   aus!Arbeitsgruppe 1 - 4 Arbeitsgruppe 5 - 8

Agarose- Gelelektro- phorese
PAGE
Befüllen des Gels