Bancos de Dados

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• Bancos de Dados

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BD de Seqüências

• Há uma quantidade gigantesca de informação sobre
  biomoléculas em BD públicos
• Mais de 348 BD
• BD de seqüências de nucleotídeos
• EMBL (http//www.ebi.ac.uk/embl)
• GenBank (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank)
• DDBJ (http//www.ddbj.nig.ac.jp)
• UniGene (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene)
• BD de seqüências de proteínas
• SWISS-PROT, TrEMBL (http//www.expansy.ch/sprot)
• PIR (http//pir.georgetown.edu)
• BD de motivos
• Pfam (http//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam)
• PROSITE (http//www.expansy.ch/prosite)
• BD de estruturas macromoleculares 3D
• PDB (http//www.rcsb.org/pdb)

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Usos de BD de Seqüências

• O que se pode descobrir sobre um gene por meio de
  uma busca a um BD?
• Informação evolutiva genes homólogos,
  freqüências dos alelos, ...
• Informação genômica localização no cromossomo,
  intros, UTRs, regiões reguladoras, ...
• Informação estrutural estruturas da proteína
  correspondente, tipos de folds, domínios
  estruturais, ...
• Informação de expressão expressão específica a
  um dado tecido, fenótipos, doenças, ...
• Informação funcional função molecular/enzimática,
  papel em diferentes rotas, papel em doenças, ...

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Busca de Informação

• Busca de informação sobre genes e produtos
  gênicos
• Gene e produtos gênicos são geralmente
  organizados por seqüência
• Seqüências genômicas codificam todas
  características de um organismo
• Produtos gênicos são descritos unicamente por sua
  seqüência
• Seqüências similares entre biomoléculas indica
  tanto uma função similar quanto um relacionamento
  evolutivo
• Seqüências de macromoléculas proporciona chaves
  biologicamente significativas para busca em BD

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Busca em BD de Seqüências

• Comece com uma seqüência, encontre informação
  sobre ela
• Muitos tipos de seqüências de entrada
• Pode ser uma seqüência de aminoácido ou de
  nucleotídeo
• Genômica, cDNA/mRNA, proteína
• Completa ou fragmentada
• Matches exatos são raros
• Em geral, o objetivo é recuperar um conjunto de
  seqüências similares

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Busca em BD de Seqüências

• O que queremos saber sobre a seqüência?
• Ela é similar ao algum gene conhecido? Quão
  próximo é o melhor match? Significância?
• O que sabemos sobre este gene?
• Genômica (localização no cromossomo, regiões
  reguladoras, ...)
• Estrutural (estrutura conhecida? ...)
• Funcional (molecular, celular e doença)
• Informação evolutiva
• Este gene é encontrado em outros organismos?
• Qual é sua árvore taxonômica?

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NCBI e Entrez

• A mais usada interface para a recuperação de
  informação de BD biológicos é o sistema Entrez do
  NCBI (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)
• NCBI (National Center for Biotechnology
  Information)
• O sistema Entrez tira vantagem do fato que há
  relacionamentos lógicos pré-existentes entre as
  entradas indíviduas encontradas em diversos BD
  públicos
• Por um exemplo, um artigo no PuBMed pode
  descrever o sequenciamento de um gene cuja
  seqüência aparece no GenBank
• A seqüência de nucleotídeos, por sua vez, pode
  codificar o produto de uma proteína cuja
  seqüência está armazenada em um BD de proteínas
• A estrutura 3D desta proteína pode ser conhecida
  - as coordenadas da estrutura podem aparecer em
  um BD de estruturas
• Finalmente, o gene pode ter sido mapeado para uma
  região específica do cromossomo - BD de
  mapeamento
• A existência dessas conexões naturais, levou ao
  desenvolvimento de um método por meio do qual
  toda a informação poderia ser encontrada sem ter
  que visitar sequencialmente BD distintos

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O Sistema Entrez (1/2)

• Para ser claro, Entrez não é um BD
• É a interface por meio da qual todos os seus BDs
  componentes podem ser acessados
• O espaço de informação do Entrez inclui
• Registros do PubMed
• Dados sobre seqüências de nucleotídeos e
  proteínas
• Informação sobre estruturas 3D
• Informação de mapeamento
• A vantagem do Entrez está no fato que toda esta
  informação pode ser acessada por meio de apenas
  uma query (consulta)

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O Sistema Entrez (2/2)
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BLAST Busca com uma Seqüência

• O objetivo é encontrar outras seqüências que são
  mais similares a query (consulta) do que seria
  esperado por ter acontecido ao acaso
• Homologia
• Pode começar com seqüências de nucleotídeos ou
  aminoácidos
• Pode fazer a busca por nucleotídeos/aminoácidos

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BLAST
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Mais que NCBI

• Links para anotações funcionais fora do NCBI
• Gene Ontology - nomes padrões para
• Funções moleculares
• Localização celular
• Processos
• Links para BD de enzimas
• Funções da enzimas
• Links para o BD KEGG (vias)

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KEGG
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Referências

• A. D. Baxevanis e B. F. Francis Ouellete (eds.).
  Bioinformatics a practical guide to the analysis
  of genes e proteins. John Wiley Sons. 2001.
• The Molecular Biology Database Collection 2003
  update -- Nucleic Acids Research 31(1)1-12

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Alinhamento de Seqüências

• Possibilitar ao pesquisador determinar se duas
  seqüências apresentam suficiente similaridade tal
  que um inferência sobre homologia pode ser
  justificada
• Homologia significa dizer que duas (ou mais)
  seqüências tem um ancestral comum
• História evolutiva
• Similaridade é uma medida da qualidade do
  alinhamento entre duas seqüências, baseada em
  algum critério
• Não se refere a nenhum processo histórico
• Apenas uma comparação das seqüências com algum
  método
• É uma afirmação logicamente mais fraca
• Em bioinformática, esses dois termos são muitas
  vezes confundidos
• A razão é provavelmente porque uma similaridade
  significativa é um forte argumento para homologia
  e, a partir disso, para a dedução de que as
  seqüências codificam um gene com uma função
  biológica similar

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Bases Evolucionárias

• Mutações
• Os eventos mais simples que ocorrem durante o
  curso da evolução molecular são substituições de
  um nucleotídeo por outro e a deleção ou inserção
  de uma par de base
• Quando uma alinhamento de seqüências refletem
  genuinamente a história evolutiva de dois genes
  ou proteínas
• Resíduos que foram alinhados mas não são
  idênticos representaria uma substituição
• Regiões onde os resíduos de uma seqüência não
  correspondem a nada na outra seria interpretado
  como ou uma inserção uma seqüência ou uma deleção
  na outra

A L I G N M E N T - L I G A M E
N T
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Relação entre Sequências
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Similaridade

• Similaridade pode ser definida contando posições
  que são idênticas entre duas seqüências
• Gaps (inserções/deleções) podem ser importantes

G A A T T C A G T T A G G
A T T C G - A
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Substituições

• Nem todo mismatch (substituições) são iguais
• Alguns aminoácidos são mais substituível entre si
• Serina e treonina são mais parecidos do que
  triptofan e alanina
• Podemos adicionar um custo diferente para cada
  tipo de mismatch (substituição)
• Em geral, não usamos custos diferentes para os
  mismatches no alinhamento de nucleotídeos
• Nenhuma substituição, por si, é melhor do que
  outra

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Gaps

• Sem gaps, há NM possíveis alinhamentos entre
  seqüências de comprimentos N e M
• Uma vez gaps são permitidos, isto se torna um
  número muito grande
• O número de possíveis alinhamentos torna-se
  exponencial no tamanho das seqüências
• Logo, não podemos experimentar todos

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Alinhamento Aleatórios

• A introdução de gaps também pode levar a
  alinhamentos sem sentido

S O M E T I M E S Q U I P S E N T I C E
S - - E - - - Q U - -
- E N - - C E

• É necessário distinguir entre alinhamentos que
  ocorreram devidoa homologia daqueles que são
  esperados a acontecer ao acaso
• Defina um esquema (função) de score (pontuação)
  que leve em consideração ambos mismatches e
  penalidades para gaps

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Match Scores

• Match scores são em geral calculadoscom base na
  freqüência de mutações particulares em
  seqüências muito similares

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Alinhamento Global e Local (1/2)

• Global
• Seqüências são comparadas como um todo
• Útil quando temos seqüências que diferem pouco
  entre si
• Inclui gaps
• Local
• O alinhamento localiza fragmentos de seqüências
  que são mais similares
• Algumas vezes não inclui gaps
• Muitas proteínas não apresentam um padrão global
  de similaridade
• Mosaico de domínios modulares
• Alinhamento de seqüências de nucleotídeos de um
  mRNA processado (spliced) com sua seqüencia
  genômica (Exon/Intron)

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Alinhamento Global e Local (2/2)
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Score do Alinhamento

• Um score (pontuação) do alinhamento é a soma de
  todos os match scores, com a penalidade subtraída
  para cada gap

A B C D E F G A C C - F G
match gap score
score 8 2 8 8 8 gt 34 - (102) 22
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Métodos de Alinhamento de Seqüências

• Dado um par de seqüências e função de score
  (pontuação), identifique o alinhamento que obteve
  o melhor score
• Alinhamento ótimo
• Lembre, há um número exponencial de alinhamentos
  possíveis
• A maioria deles com scores muito ruins
• Alinhamento de pares de seqüências
• Matriz de pontos (dot matrix)
• Programação dinâmica
• Dicionário de palavras ou k-tuplas (BLAST)

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Matriz de Pontos

• Permite a inspeção visual de um possível
  alinhamento entre duas seqüências
• Permite que repeats e inversões sejam detectadas
• Permite a identificação de regiões
  auto-complementares (e.g., RNA com estrutura
  secundária)
• O alinhamento não é produzido

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Exemplo

• Seqüências
• ATGCGTCGTT
• ATCCGCGAT

• Passos
• Organize as seqüências em uma matriz
• Coloque um ponto em cada lugar que houver um
  match entre duas bases
• Trechos diagonais (indicados por linhas) são
  áreas de alinhamento
• Mais de um alinhamento pode surgir

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Assuntos Abordados

• BLAST original
• Gapped BLAST
• PSI-BLAST
• PHI-BLAST

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Original BLAST (Proteínas)

• Determinando as sementes
• Sementes de tamanho fixo (w)
• Pontuação mínima para a semente (T)
• Procurando ocorrências
• Tabela com todas as palavras de tamanho w
• Autômato finito baseado em transições (Mealy)
• Estendendo um alinhamento
• Alinhamento sem gaps
• Limite para expansão de alinhamento (X)

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Original BLAST (DNA)

• Determinando as sementes
• Todas as seqüências de tamanho fixo (w) n-w1
  sementes
• Banco de dados comprimido
• 4 nucleotídeos armazenados em um byte
• Buscas por casamentos são acelerados por um fator
  4
• Filtros
• Regiões pouco significativas (SEG)
• Repetições

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Estatísticas paracomparação local (1)

• Número esperado de seqüências (E-value) com score
  maior ou igual a S é dado por
• Calculando o score normalizado (bit score)

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PSI-BLAST

• Variante do BLAST que permite comparar proteínas
  fracamente relacionadas, mas com regiões bem
  conservadas.
• Position-Specific Score para cada posição da
  seqüência usada como query, um valor é associado
  para cada resíduo. Quanto mais conservado o
  resíduo, maior o score.
• Para uma seqüência de tamanho L, a matriz de
  pontuação terá tamanho L x 20.

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PSI-BLASTOs 5 Passos

1. Compara a query com um banco de proteínas usando
   Gapped BLAST.
2. É construído um alinhamento múltiplo, e a partir
   deste um perfil (seqüência matriz de
   pontuação).
3. O perfil é comparado com o banco de proteínas em
   busca de alinhamentos locais.
4. PSI-BLAST estima a significância estatística dos
   alinhamentos encontrados.
5. Finalmente, PSI-BLAST retorna ao passo 2 por um
   número arbitrário de vezes, até convergir.

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Performance do PSI-BLAST
Teste com 11 famílias de proteínas
Smith- Watterman Original BLAST Gapped BLAST PSI-BLAST
Total de Hits (E ? 0.01) 1739 1656 1731 2649
Tempo Normalizado 36.0s 1.0s 0.34s 0.87s
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PHI-BLAST

• Recebe como entrada uma seqüência de aminoácidos
  e um padrão (estilo PROSITE) existente nesta
  seqüência.
• Apenas as seqüências do banco que baterem com
  este padrão serão consideradas.
• O padrão é usado como semente para o alinhamento
  local gerado pelo BLAST.

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O Algoritmo do PHI-BLAST

• A busca por seqüências do banco de dados que
  batem com o padrão é realizada com uma adaptação
  dos métodos propostos por Baeza-Yates Gonnet e
  Wu Manber.
• O alinhamento das seqüências é realizado com a
  heurística do Gapped BLAST.
• O algoritmo só permite o uso de padrões
  relativamente raros no banco de dados.

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PHI-BLASTAnálise Estatística

• Score de um alinhamento SSleftS0Sright
• Score relevante SSleftSright
• Probabilidade de se obter um score ? S
• Número de alinhamentos com score ? S

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PHI-BLASTExemplo (E-Value)
Exemplo Padrão PHI-BLAST BLAST
A GAxxxxGKST 0.038 4.7
B hxhxDxGxG 0.017 1.8
C DhDhhh 0.061 8.6
D QxxGRxGAR 0.54 -
40
PHI-BLASTExemplo (Tempo)
Exemplo Tamanho Hits PHI-BLAST BLAST
A 549 14582 26s 77s
B 615 2986 12s 103s
C 449 1890 10s 71s
D 424 672 9s 64s