Le tecniche di coltura in vitro

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Le tecniche di coltura in vitro

• Francesco Sunseri

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La definizione
the aseptic culture of plant protoplasts,
cells, tissues or organs under conditions which
lead to cell multiplication or regeneration of
organs or whole plants (Murashige, 1963)
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Argomenti da trattare

1. Concetti fondamentali / Storia
2. Tipi di cellule o tessuti
3. Processi di crescita
4. Regolatori di crescita

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Che cosa sono

• La coltura di cellule e tessuti di piante trova
  il suo fondamento nella totipotenza cellulare
• In tutte le piante vascolari lembrione si evolve
  in una struttura bipolare per la presenza di due
  meristemi apicali
• Durante il ciclo della pianta tali meristemi
  producono continuamente nuovi organi che si
  aggiungono a quelli prodotti durante
  lembriogenesi

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Che cosa sono

• Le piante vascolari sono state pertanto definite
  organismi a ontogenesi ricorrente, a causa di
  tale fenomeno nelle piante non si assiste alla
  separazione tra linea somatica e linea germinale
• Durante lo sviluppo gli apici vegetativi possono
  modificarsi in apici riproduttivi, sviluppando le
  strutture tipiche della riproduzione
• Per entrambe queste ragioni nelle piante
  vascolari qualsiasi cellula somatica può
  considerarsi un progenitore potenziale di un
  nuovo individuo

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Coltura in vitro

• Il termine sottende a differenti metodologie che
  consentono la crescita e lo sviluppo di cellule,
  tessuti ed organi vegetali su terreni sintetici
• La crescita e la moltiplicazione di nuove cellule
  si può indurre anche da tessuti già differenziati
  che subiscono un processo di sdifferenziamento
• Si formano quindi ammassi amorfi, definiti calli,
  che possono essere mantenuti indefinitamente in
  vitro o possono essere indotti a rigenerare
  organi o piante intere

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Callo

• Rappresenta la naturale risposta della pianta ad
  una ferita
• E una massa di cellule in attiva divisione per
  la produzione di cellule indifferenziate prodotte
  da espianti di tessuto vegetale
• E formato da cellule totipotenti

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Coltura in vitro

• Tutti i vegetali possono essere considerati
  sorgenti potenziali di cellule per coltura in
  vitro
• Alcune specie sembrano fare eccezione a tale
  regola, ma è probabile una erronea scelta delle
  condizioni colturali
• Infatti le condizioni colturali possono mostrare
  differenze significative in relazione a sostanze
  specifiche e condizioni microambientali utilizzati

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Principali caratteristiche

• Si effettuano
• su micro scala
• in condizioni ambientali ottimizzate
  (nutrienti, luce, temperatura)
• in assenza di microrganismi (funghi, batteri,
  virus).

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1. Storia

• Teoria cellulare e totipotenza
• Formazione del callo e sostanze di crescita
• Prime colture cellulari
• Prime colture di tessuti vegetali
• Colture di organi vegetali

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Teoria cellulare .
Le cellule furono osservate per la prima volta
nel 1664 da Robert Hooke, che studiò con un
microscopio rudimentale sottili fettine di
sughero e vide che esse erano formate da elementi
di forma regolare. Egli chiamò cellule questi
elementi (dal latino cellula, "piccola stanza"),
perché esse avevano l'aspetto di piccole scatole.
Cork tissue as observed by Robert Hooke in 1664
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Le prime colture cellulari.
Haberlandt .. agli inizi del 1900 propose il
concetto di totipotenza cellule allevate
in adatte conditizioni
Callo coltivato a partire dal cambio
(Gautheret, Nobecourt, Whire nel 1930)
le cellule restavano vive ma non si moltiplicavano
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Le prime colture di tessuti .
- in funzione della scoperta dei
Regolatori di crescita

• Distensione cellulare ruolo delle auxine
• Divisione cellulare ... ruolo delle citochinine

• Rigenerazione di tabacco .... (Skoog and
  Miller) . interazione tra auxine e
  citochinine dava differenziazione.

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Successivi sviluppi

• GA per la crescita dei germogli
• Aux Cyt zucchero gt sviluppo
  vascolare
• Colture di strati sottili interazione con
  altri fattori es. pH

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• Il primo uso commerciale di piante propagate su
  mezzo artificiale è stato fatto per la
  germinazione e lo sviluppo di orchidee nel 1920

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Pianta di carota da cellule radicali Stewart in
1964
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Pianta di tabacco da singola cellula Vasil
Hilderbrandt 1965
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Coltura di organi vegetali . ma la coltura
delle piante in vitro ha visto il suo pieno
sviluppo grazie alla messa a punto di un mezzo di
coltura artificiale da parte di Murashige
Skoog nel 1962 ? micropropagazione
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2. Tipi di cellule e tessuti

• Molti tipi di cellule
• Grado di specializzazione diversificato

- Meristematico - Embrionale - Riproduttivo
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Tessuti meristematici ...

• Germoglio ... apicale, ascellare

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apical meristem
leaf trace
axillary meristem
procambium
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Tessuti meristematici ...

• Germogli ... apicali, ascellari

• Foglie

• Radici

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Tessuti embrionali ...

• Piante pre-formate
• Germinali / somatici
• Giovanile

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Tessuti riproduttivi ...

• Diploide / Aploide
• Femminile / Maschile

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3. Processi di crescita

• Moltiplicazione
• Dominanza apicale
• Differenziazione
• Crescita
• Divisione cellulare
• Distensione cellulare
• Fasi di sviluppo
• Giovanilità
• Dormienza

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3. Altri processi

• Fotosintesi
• Traspirazione e assorbimento dellacqua
• Instabilità citologica
• Meccanismi fisiologici
• Manipolazioni fisiche
• Ambiente
• Genotipo

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4. Regolatori di crescita

• Le auxine
• Le citochinine
• Le gibberelline (GA)
• Lacido abscissico (ABA)
• Letilene

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Regolatori di crescita

• Auxine

• Essenziali (non sono noti effetti mutageni)
• Il solo composto naturale è lo IAA
  (Indole-3-Acetic Acid). Altri prodotti sintetici
  sono NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T, Pichloram) meno
  costosi e più stabili
• Stimolazione della distensione cellulare in fusti
  e coleoptili
• Promuovono la radicazione
• Sono sintetizzate nei meristemi, specialmente in
  quelli apicali (inibizione della crescita delle
  gemme laterali)

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Regolatori di crescita
Citochinine

• Essenziali (non sono noti effetti mutageni)
• Un solo composto naturale la Zeatina analoghi
  sintetici sono Benzyladenine (BA) e Kinetin
• Stimola la divisione cellulare
• Promuove la formazione di gemme avventizie
• Sono sintetizzate nel meristema radicale e
  trasportate nel floema sotto forma di
  Zeatin-riboside

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Regolatori di crescita
Gibberelline

• Questa classe comprende più di 70 composti, varie
  forme dell acido gibberellico
• In commercio sono disponibili diversi formulati
  (GA3, GA4, GA9)
• Stimola leziolatura dello stelo
• Sintetizzate nelle giovani foglie

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Regolatori di crescita
Acido abscissico (ABA)

• Esiste solo un componente naturale
• Promuove labscissione delle foglie e la
  dormienza dei semi
• Gioca un ruolo dominante nella chiusura degli
  stomi in condizioni di stress idrico
• Ha un ruolo importante nellembriogenesi (aiuta
  la formazione di embrioni normali)

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• Bilancio ormonale
• Auxine Citochinine
• Alte Basse
• Basse Alte

• Formazione di radici dopo il taglio
• Embriogenesi
• Formazione di radici avventizie
• Induzione a callo
• Formazione di germogli avventizi
• Crescita di germogli ascellari

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Rapporto auxine citochinine
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Azione dellormone per ..

• Applicazione assorbimento
• Endogeno applicato
• Accumulazione e assuefazione
• Interazione / Sequenza di applicazione
• Impulso o esposizione prolungata

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Mezzo di coltura in vitro

• Elementi minerali (17 elementi essenziali)
• Fonte denergia e di carbonio (saccarosio)
• Regolatori di crescita (fitormoni)
• Vitamine
• Composti organici
• Acqua
• pH (5.0-5.7)
• Gelling agents Agar, agarose, gellan gum

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Composti inorganici

• Macroelementi (gtmg/l di N, P, K, Ca, Mg e S) e
  microelementi (ltmg/l Fe, Cu, Mn, Co, Mo, B, I,
  Zn, Cl e alcune volte Al, Ni e Si).
• Disponibili formulazioni commerciali in polvere
• Murashige and Skoog Medium (1965) è il mezzo di
  coltura più comune
• Il mezzo Gamborgs B5 è più diffusamente
  utilizzato per colture cellulari in sospensione.

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Vitamine

• Un ampio range di vitamine sono disponibili e
  possono essere usate
• Generalmente, più è piccolo lespianto, più
  appropriata deve essere la scelta della/e
  vitamine
• Un cocktail di vitamine è spesso usato
• Linositolo di solito deve essere aggiunto a
  maggiori concentrazioni (100mg/l)

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Vitamine

• Tiamina
• Piridossina
• Acido nicotinico
• Biotina
• Acido Citrico
• Acido Ascorbico
• Myo-inositolo

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La rigenerazione può avvenire

• via organogenesi
• via embriogenesi somatica

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Organogenesi

• Lorganogenesi prevede la formazione di germogli,
  foglie e radici e si verifica quando si
  differenziano in vitro centri meristematici
  unipolari quali le gemme avventizie
• Questi organi possono derivare da meristemi
  preesistenti o da cellule indifferenziate
• Come per lembriogenesi può aversi una fase
  intermedia di callo, ma spesso si osserva senza
  il passaggio da questo stadio

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Organogenesi
La differenziazione di radici e germogli in
colture di tessuto di tabacco era funzione del
rapporto auxine-citochinine, e la
differenziazione dellorgano potrebbe essere
regolato dal cambiamento delle concentrazioni
relative delle due sostanze nel mezzo di coltura
1957 Skoog and Miller
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Embriogenesi Somatica

• Lembriogenesi somatica consiste nella produzione
  di embrioni da cellule somatiche o non
  germinanti, la rigenerazione comporta la
  successione delle fondamentali fasi di sviluppo
  che caratterizzano la differenziazione
  dellembrione zigotico
• Si assiste quindi alla comparsa di una struttura
  bipolare, priva di connessioni vascolari con il
  tessuto originario, che evolve in un embrione
  cotiledonare

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Acclimatamento

• Le piante ottenute in vitro devono essere
  preparate alla sopravvivenza in vivo
• Alta umidità
• Luce
• Temperature tra 20-25C
• Elementi nutritivi
• Terreno adatto

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(No Transcript)
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Applicazioni delle colture in vitro

• micropropagazione e rapida moltiplicazione di
  cloni
• rigenerazione e trasformazione genetica
• induzione di variazione somaclonale
• ottenimento di aploidi da micro e macrospore
• allevamento e mantenimento di piante virus esenti
• manipolazione di protoplasti ed ibridazione
  somatica
• conservazione del germoplasma
• produzione di metaboliti di interesse industriale

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Plant GeneticTransformation
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Overview

• Introduzione
• Plant genetic transformation
• Stato attuale delle PGM
• Trends futuri e problemi

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Introduzione

• Potenzialità delle biotecnologie vegetali
• Uso di nuovi geni introdotti
• Tratti che i plant breeders vorrebbero trasferire

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Tratti genetici di interesse per i plant breeders

• Resistenza a stress idrico
• Resistenza a stress biotici
• Adattabilità alla meccanizzazione
• Insensibilità al fotoperiodo
• Eliminazione di composti tossici

• Alta produttività
• Alta qualità nutrizionale
• Adattabilità allinter-cropping
• Fissazione dellazoto

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Sviluppo dei cibi GM
Prima rigenerazione di piante intere da in vitro
culture
1950
La ricerca sviluppa capacità ad isolare geni
1973
1 pianta transgenica tabacco resistente ad
antibiotico
1983
PGM resistenti a insetti, virus e batteri sono
saggiate in campo per la prima volta TRATTI
UTILI
1985
Primo campo di cotone GM condotto con successo
1990
Pomodoro Flavr-Savr 1 FDA approvazione per un
cibo
1994
Soia Roundup della Monsanto approvata per il
commercio negli Stati Uniti
1995
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Metodi di trasformazione genetica

• Trasformazione biologica
• Biolistico - gene gun o particle gun
• Elettroporazione
• Microiniezione

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Trasformazione biologica

• Agrobacterium tumefaciens A. rhizogenes
• causano infezione nelle piante
• le formazioni tumorali sono la conseguenza del
  trasferimento, da parte del batterio, di un
  segmento di DNA, chiamato T-DNA

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Agrobacterium gene transfer
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Esempio di protocollo per la trasformazione con
Agrobacterium
Sterilizzare
Espianto fogliare
Incubare con Agrobacterium
Blot disk dry
Leaf disk
Trasferire su mezzo di induzione del germoglio
carbenicillina in coltura 2 giorni
Transferire su mezzo per indurre germoglio
carbenicillina selettivo per il transgene (es.
kanamicina), coltivare/subcoltivare fino a che si
formano i germogli
Trasferire le plantule nel terreno appena si
formano le radici
Excidere i germogli dal callo, trasferire su
mezzo di radicazione
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Tratti transgenici inseriti

• 74 resistenza ad erbicidi (soia, canola)

• 19 resistenza ad insetti (mais, cotone)

• 7 altri caratteri

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(No Transcript)
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(No Transcript)