Test - Sreening - Acondroplasia

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Test - Sreening - Acondroplasia
Lezione 3
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Cose lanalisi analisi genetica

• Lanalisi individua il genotipo di individui a
  rischio per ben definite patologie. Oggi possono
  essere identificate anche prima della nascita
  piu di 300 malattie genetiche.

• La maggior parte sono rare e lanalisi viene
  fatta
• solo quando ce una indicazione precisa

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Cose lo screening

• Lo screening genetico si effettua su una
  popolazione o
• su un gruppo di individui non imparentati.

• Non si possono fare screening per tutte le
  possibili
• malattie si effettua su una popolazione in cui
  una
• particolare patologia ha unincidenza
  significativa
• es.Tay-Sachs nei canadesi francofoni o negli
  ebrei
• orientali. Lanemia falciforme nel bacino
  mediterraneo, la
• talassemia.......

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Quando eseguire i test genetici I
Rischio noto di una particolare malattia in un
feto o in sospetti portatori

• Se la mutazione e gia nota perche si e
  studiato
• il precedente affetto e relativamente semplice.
• Se la patologia e recessiva le mutazioni da
  ricercare
• potrebbero essere 2

• Se la mutazione non e nota la strategia e piu
  
• complessa e potrebbe non portare a dei risultati
  utili
• come per CF. In questo caso si ricorre al linkage

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Quando eseguire i test genetici II
Screening nei neonati

• La popolazione da testare e ben identificata

• Lanalisi e economica e rapida

• E possibile anche nel caso degli affetti
• intervenire per impedire la comparsa della
• patologia fenilchetonuria

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Quando eseguire i test genetici III

• Confermare o smentire una diagnosi clinica
• penetranza, eterogenita genetica, fenocopie

• Identificare lo stato di portatore nel caso di
  patologie
• ad insorgenza tardiva o di suscettibilita a
  patologie
• tumorali

• Confermare il coinvolgimento nella patogenesi di
  una
• malattia di un gene candidato clonato

• In futuro identificare geni che predispongono
  alla
• comparsa di patologie complesse

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Premesse
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Premesse
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Quando non si e trovato niente di noto
Quando si sono testate le mutazioni gia note e
non si e arrivati a definire la presenza della
mutazione, prima di ricorrere al sequenziamento
vero e proprio di tutto il gene, si puo
ricorrere a tecniche per evidenziare differenze
fra la sequenza normale e la mutata, anche senza
conoscerne la sequenza (SSCP, DDGE....)
Il principio su cui si basano e quello per cui
una variazione anche di una sola base modifica la
conformazione del DNA in condizioni sperimentali
definite,o evidenziano grosse alterazioni della
sequenza (delezioni, duplicazioni...)
attenzione pero a variazioni polimorfiche

• Polimorfismo variazione la cui frequenza sia
  maggiore di 0,01(1)

• Eterozigosi media per il DNA genomico umano
  0,0037 (0,37). Cio significa che in due alleli
  circa 1250-11000 basi sono diverse

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Strategie per seguire le tracce del gene (gene
tracking)
Non si puo fare lanalisi diretta della
mutazione gene non clonato o non si sono
individuate mutazioni nella sequenza del gene
Prerequisiti 1) Malattia mappata per poter
identificare in banca dati marcatori il piu
strettamente associati. 2) la struttura della
famiglia e la disponibilita dei campioni devono
permettere di ricostruire la fase.

• Tre fasi
• Distinguere i due cromosomi(aplotipi) del(i)
  gentore(i) che possono aver
• trasmesso il gene malattia
• 2) Determinare la fase
• 3) definire quale aplotipo ha ereditato il
  probando dai genitori

Questa logica si applica a fenotipi con qualunque
tipo di ereditarieta. Linformativita dei
marcatori non e piu un problema ci sono oggi
microsatelliti altamente informativi mappati su
tutto il genoma. Il limite piu grosso e dato
dalla struttura della famiglia
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Strategie per seguire le tracce del gene (gene
tracking)
Patologia dominante (espressivita variabile,
penetranza risotta, insorgenza
tardiva)
2) identificato un marcatore per cui II3 e
eterozigote
4) identificare il genotipo di III2, analizzando
lei e II4
3) identificare con quale allele segrega il
fenotipo (fase)
Quali sono i risultati possibili?
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Strategie per seguire le tracce del gene (gene
tracking)
Patologia dominante (espressivita variabile,
penetranza risotta, insorgenza
tardiva)
Risultati possibili
III2 2-1 o 2-3 NON eportatrice, perche in
questa famiglia la regione mutata e
identificata dallallele 1
III2 1-1 o 1-3 E portatrice, perche in questa
famiglia la regione mutata e identificata
dallallele 1
ATTENZIONE e importante la segregazione
allinterno della famiglia e non il particolare
genotipo se III2 avesse 2-1 cioe lo stesso
genotipo della madre malata, non sarebbe
portatrice
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Strategie per seguire le tracce del gene (gene
tracking)
Linformativita dei marcatori non e piu un
problema ci sono oggi microsatelliti altamente
informativi mappati su tutto il genoma il limite
piu grosso e dato dalla struttura della famiglia
Stesso fenotipo recessivo e segregazione in 4
famiglie diverse
Impossibile il test perche non ce il DNA di
riferimento dellaffetto
50N, 50 affettonon si puo definire di chi
sono gli alleli ereditati dal feto. Lallele 2
del feto e lo stesso della sorella?
Normale 1-1
Portatore 2-1
Nessuna previsione come prima
Affetto 2-2
Lerrore diagnostico puo venire dalla
ricombinazione che deve essere la piu bassa
possibile
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Diagnostica I

• le informazioni sulle malattie sono reperibili
  oltre che come PDF anche direttamente al sito
  http//www.genetests.org cliccare su laboratory
  directory nella barra

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il sito
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il sito
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il sito
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Acondroplasia
Velazquez
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Acondroplasia I
Il gene coinvolto in questa patologia e FGFR3
(Fibroblast growth factor receptor-3), che mappa
in 4p16.3 (telomero del cromosoma 4), contiene 19
esoni, e lungo 16.5 Kb ed e lunico le cui
mutazioni siano state collegate allacondroplasia.
Il recettore ha 3 domini Ig-like, un dominio
transmembrana e un dominio citoplasmatico
tirosinochianasico
Sembra che il ruolo fisiologico di questo
recettore sia quello di controllare negativamente
la proliferazione e il differenziamento nel
centro di ossificazione. Le mutazioni avrebbero
come risultato di mantenere sempre attivo il
recettore e quindi il loro effetto si puo
configurare come aumento di funzione
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considerazione importante
Sembra che il ruolo fisiologico di questo
recettore sia quello di controllare negativamente
la proliferazione e il differenziamento nel
centro di ossificazione. Le mutazioni avrebbero
come risultato di mantenere sempre attivo il
recettore e quindi il loro effetto si puo
configurare come aumento di funzione

• Bisogna sempre ricordare che la dominanza attiene
  al fenotipo e quindi e leffetto della mutazione
  sulla funzione del prodotto che provoca la
  dominanza del fenotipo mutato sul wildtype.
  Quindi leffetto della mutazione dipende da

• quale e la funzione del wt e sensibile alla
  dose sia in piu che in meno? e quindi la
  mutazione provoca un aumento o una diminuzione
  dellattivita del prodotto?

• Questo vale per tutti i geni e i loro prodotti !!!

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Acondroplasia II
Lacondroplasia e una patologia originata ad un
anormale sviluppo osseo. E una patologia
autosomica dominante, oltre l80 degli affetti
hanno genitori con statura normale e sono
originati da una mutazione de novo, quindi il
rischio di ricorrenza e basso (attenzione al
mosaicismo germinale)
Nel caso di una coppia in cui uno dei partner sia
affetto, il rischio di ricorrenza e 50, se
entrambi sono affetti 25 non affetti, 50
affetti, 25 letali per lomozigosi.
Sembrerebbe collegata con aumentata eta paterna,
proprio per il relativamente alto tasso di nuove
mutazioni. Il mosaicismo germinale sembra essere
la causa delle rare famiglie con ricorrenza

• Perche la diagnosi molecolare?
• per confermare un sospetto diagnostico
• per una diagnostica prenatale ( mosaicismo
  germinale)

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Acondroplasia III

• Analisi di mutazioni note sono note 2 mutazioni
  patogenetiche che vengono ritrovate (una sola!)
  nel 99 degli affetti. Entrambe sono a carico
  del codone 380 al nucleotide 1138 e provocano, a
  causa della sostituzione della prima base della
  tripletta, la sostituzione di una glicina con una
  arginina nel dominio transmembrana G380R.
• Nel 98 e una transizione GgtA
• nell1 e una trasversione GgtC
• il restante 1 puo essere dovuto ad altri
  alleli rari
• GgtT codone 375 glicinagtcisteina
• AgtG codone 650 lisinagt glutamina
  (letalenanismo thanatoforo)
• .......

Per tutte la tecnica e la ARMS o analoghe la
sequenza wt e mutata sono note. E se non ci sono
le mutazioni note? e si deve fare una diagnosi
prenatale?
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Test per mutazioni note
Ricerca di mutazioni puntiformi ARMS
(Amplification Refractory Mutation System) si
eseguono 2 reazioni di PCR in parallelo IN 2
PROVETTE in una i primer sono entrambi per la
sequenza normale, nellaltra un primer e un ASO
specifico per la mutazione. Si ha la banda di
amplificazione solo se entrambi i primer si
appaiano. Di solito il test e multiplex
utilizzando primer che permettano di vedere
piccole variazioni nella corsa elettroforetica.
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I multiplex
Allele A M
Allele B N
Allele C N
DF508N
Allele D N
Allele E N
CFTR
Allele A N
Allele B N
Allele C N
DF508N
Allele D M
Allele E N
A m B m C m DF508 n Contr
D m E m DF508 M Contr.
A M DF508 n Contr,
D M Contr.
DNA primer
AM
DM
PCR
D508N
Contr.
Reazione 1
Reazione 2
Reazione 1
Reazione 2
1
2
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Acondroplasia IV
Sequenziamento tenendo presente che se si trova
una mutazione

• Mutazione mai descritta in letteratura, ma che
  potrebbe essere patogenetica (il meccanismo di
  azione del prodotto e noto) e presente in
  altri soggetti sani della famiglia?

• Mutazione mai descritta in letteratura, con
  effetto ignoto sulla funzionalita e presente
  in soggetti sani della famiglia?

• Mutazione mai descritta in letteratura, ma il
  cui effetto si ritiene innocuo sulla
  funzionalita e presente in soggetti sani della
  famiglia?

• Mutazione descritta in letteratura, il cui
  effetto e accertato essere innocuo sulla
  funzionalita (come?)

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Acondroplasia V
Sequenziamento si e risposto SI a tutte le
domande precedenti, quindi non si e trovato
niente di chiaramente patogenetico. Che vuol dire?
Il probando, chiaramente malato, ha una mutazione
ad un altro locus, Diagnosi errata o il prodotto
del secondo ipotetico locus interagisce con il
primo e quindi il fenotipo e uguale
Il probando, chiaramente malato, ha una mutazione
non visibile perche si manifesta durante la
maturazione dellRNA.
E quindi che faccio?
Nel caso dellacondroplasia lecografia prenatale
mi aiuta e non e il caso di ricorrere al linkage
perche non esistono portatori silenti la
penetranza e totale e non ce espressivita
variabile.
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Acondroplasia VI
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Acondroplasia VII