Uticaj pH i temperature na enzimsku aktivnost Tehnike merenja u enzimskoj kinetici

1
Uticaj pH i temperature na enzimsku
aktivnostTehnike merenja u enzimskoj kinetici
2
Uticaj temperature na enzimsku aktivnost
Temperaturni optimum Termalna stabilnost
kAe-Ea/RT
3
Temperaturni optimum enzima
- Efekat temperature na stabilnost preoteina
(enzima)
Efekat temperature na konstantu brzine
4

• Termalna stabilnost enzima nije isto što i
  temperaturni optimum enzima!
• Preinkubacija na razlicitim T, odredjivanje
  rezidualne aktivnosti enzima
• Reverzibilnost procesa
• Konstanta denaturacije
• Zavisnost kataliticke aktivnosti od T

5
(No Transcript)
6
(No Transcript)
7

• Ac(t) Aco e-kt
• Ac(t) - aktivnost enzima nakon vremena t
  provedenog na datoj temperaturi
• Aco - aktivnost enzima pre inkubiranja na datoj
  temperaturi

8
Uticaj pH na aktivnost enzima

• Uticaj pH na stabilnost (_____) i aktivnost
  (........) enzima

Efekat pH na jonizaciju kataliticki aktivnih
grupa u enzimu i/ili grupa koje vezuju supstrat
Efekat pH na denaturaciju proteina
9
Jonizacija jednostavnih kiselina i baza osnovne
jednacine
10
(No Transcript)
11
Jonizacija jednostavnih kiselina baza osnovne
jednacine
L konstanta brzine, ekstikcioni koeficijent,
konstanta ravnoteže
12
(No Transcript)
13
(No Transcript)
14
Jonizacija jednostavnih kiselina baza osnovne
jednacine
15
Efekti jonizacije grupa u enzimima na kinetiku1.
Mihaelis-Mentenov mehanizam
16
Efekti jonizacije grupa u enzimima na kinetiku1.
Mihaelis-Mentenov mehanizam
17
Efekti jonizacije grupa u enzimima na kinetiku
18
Efekti jonizacije grupa u enzimima na kinetiku
pH zavisnost kcat
pH zavisnost Km
pH zavisnost 1/Km
pH zavisnost kcat/Km
19
Jonizacija jednostavnih kiselina baza osnovne
jednacine
Sistemi sa dve jonizujuce grupe
Ukoliko aktivnost enzima zavisi od jonizujuceg
stanja dve grupe, pri cemu je jedna bazna, a
druga kisela, tada je zavisnost brzine reakcije
od pH oblika zvonaste krive, sa maksimumom na pH
(pKa1 pKa2)/2
20
(No Transcript)
21
(No Transcript)
22
(No Transcript)
23
(No Transcript)
24
(No Transcript)
25
(No Transcript)
26
(No Transcript)
27
(No Transcript)
28
Modifikacije odstupanje Jednostavne teorije

• Modifikacije zbog dodatnih intermedijera
• Intermedijeri na reakcionom putu

Ukoliko je EA glavna vrsta intermedijera na
reakcionom putu, pH zavisnost kcat i Vmax ce
dati pKa vrednosti za EA
29
Modifikacije odstupanje od jednostavne teorije

• Modifikacije zbog dodatnih intermedijera
• b) Neproduktivni nacini vezivanja

Neproduktivno vezivanje nece uticati na pH
zavisnost konstante specificnosti
30
Ilustrativni primeri eksperimentalni dokazi

• Slobodan enzim
• Korak koji odredjuje brzinu se ne menja sa pH S
  je
• nejonizujucigt pKa pKa slobodnog enzima

31
Ilustrativni primeri eksperimentalni dokazi
Kompleks enzim-supstrat po vezivanju S, pKa
aktivnog mesta se može promeniti Jonizacija na
visokom pH
32
Efekti temperature, polariteta rastvaraca
jonske snage na pKa grupa u enzimima rastvoru
33
Velika variranja pKa u enzimima
34
Direktna titracija grupa u enzimima
2. Metode NMR IR spektroskopija UV diferencijalna
spektroskopija Fluorescencija Diferencijalna
titracija (može i uz denaturaciju) Hemijske
modifikacije
35
Odredjivanje konstanti disocijacije za
protein-ligand interakcije
Ekvilibrijumska dijaliza
Neekvilibrijumska dijaliza se koristi za brza
odredjivanja, pri cemu se odredjuje brzina
difuzije kroz polupropustljivu membranu
36
Ekvilibrijumska gel filtracija
Primenljiva i za enzime
37
Ultracentrifugiranje
Filter testovi Spektroskopske metode Mikrokalorime
trija
38
Stehiometrijska titracija
39
Surface Plasmon Resonance BiosensorOdredjivanje
konstanti disocijacije
40
Merenja individualnih konstanti brzina
41
Merenja individualnih konstanti brzina
Metoda stalnog protoka
Vrednosti za kcat su u opsegu 1 107 s-1
42
(No Transcript)
43
Metoda zaustavljenog protoka
44
Metoda zaustavljenog protoka
45
Metoda prekinutog protoka
46
Tehnika prekinutog protoka
47
Tehnika pulsnog prekinutog protoka
48
Flash fotoliza
Odgovorajuci supstrati cesto nisu dostupni Za
enzime koji zahtevaju ATP i GTP razvijen je
supstrat tzv. caged ATP, odnosno GTP Time scale
reda ms
49
Relaksacione metodeTemperature jump
50
(No Transcript)
51
(No Transcript)
52
(No Transcript)
53
(No Transcript)
54
(No Transcript)
55
Konstante brzina enzimskih reakcija i procesi
koji odredjuju brzinu
56
Enzimi koji postižu kataliticku perfekciju