Mikroskopick

1
Mikroskopická technika

• Vladimír Hampl, Veronika Sacherová, Jana
  Albrechtová

2
Co vás tu ceká?

• Svetelná mikroskopie (V. Hampl kol.)
• Speciální svetelná a fluorescencní mikroskopie
  (V. Hampl a kol.)
• Elektronová mikroskopie (V. Sacherová a kol.)
• Základy obrazové analýzy (J. Albrechtová a kol.)

3
Co potrebujete na zápocet?

• Minimálne 75 úcast na praktiku
• Odevzdání protokolu
• vypracovaných behem cvicení
• Nákresy delejte velké,
• Kreslete, co vidíte v mikroskopu a ne, co je v
  naší prezentaci,
• nestínujte, nešrafujte.

4
Doporucené studijní materiály

• Naše webové stránky, kde jsou uvedeny prezentace
  k prednáškám i odkazy na literaturu

• http//natur.cuni.cz/parasitology/parpages/mikrosk
  opickatechnika/

5
Neco navíc o svetelné mikroskopii

• Knihy a skripta
• Dušan Matis a kolektív Mikroskopická technika.
  Skriptum PrF Univerzity Komenského, 1993
• Jaromír Plášek Nové metody optické mikroskopie.
  Skriptum Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy
• Petr Smékal Experimentální metody biofyziky II,
  Svetelná a elektronová mikroskopie. Skriptum PrF
  Ostravské Univerzity, 1995

• Casopis Vesmír
• Mikroskopy, veda, prumysl... 1997/10, str. 576
• Mikroskopie (barevná dvojstrana uprostred
  casopisu). 2004/3
• Jaromír Plášek Promeny svetelné mikroskopie ve
  20. století. 2004/3, str. 146

A samozrejme internet!!! Napríklad stránky
firem vyrábejících mikroskopy
6
Svetelná mikroskopie
7
Krátký pohled do historie mikroskopování

• 1590-1610 otec a syn Janssenové, první mikroskop
• 17. -18. století A. Leeuwenhoek
• 1847 prumyslová výroba mikroskopu firmou Zeiss
• 1911 C. Reichert, fluorescencní mikroskop s UV
  excit.
• 1932 F. Zernick, fázový kontrast
• 1955 Nomarski, diferenciální interferencní
  kontrast
• 1968 rastrovací tandemový konfokální mikroskop
• 1978 laserový konfokální rastrovací mikroskop

8
Krátký pohled do historie mikroskopování
http//www.botany.ubc.ca/keeling/resomicr1.html
9
Krátký pohled do historie mikroskopování
10
Svetlo
Zpusoby popisu ve fyzice Vlnový model
(elektromagnetické vlnení) Kvantový model (proud
fotonu) Geometrický model (svetelný paprsek)
11
Svetlo

• Rychlost (c) Ve vakuu 3 x 108 m/s
• Vlnová délka (l) Vzd. mezi odpovídajícími si body
  sinusoidy
• Amplituda (A) Nejvetší odchylka sinusoidy od
  nulové hodnoty
• Fáze (f) Udává v jaké cásti sinusoidy se vlnení
  nachází v urc. casovém úseku
• Frekvence (f) Pocet kmitu za jednotku casu

12
Svetlo
13
Ohyb (difrakce) a skládání (interference) svetla
14
Ohyb (difrakce) a skládání (interference) svetla
15
Ohyb (difrakce) a skládání (interference) svetla
16
Odraz a lom svetla
úhel dopadu úhel odrazu
17
Odraz a lom svetla
ridší prostredí hustší
prostredí lom ke kolmici
18
Odraz a lom svetla
lom od kolmice ridší prostredí
hustší prostredí
19
Cocka
Svetelné paprsky šírící se z urcitého bodu
predmetu ruznými smery a dopadající na cocku se v
obrazové rovine sbíhají opet do jednoho bodu a
skládají tak ostrý obraz predmetu
20
Cocka
21
Cocka
22
Cocka vznik obrazu
F
F
23
Vznik obrazu ve svetelném mikroskopu
24
Vznik obrazu ve svetelném mikroskopu
25
Vznik obrazu ve svetelném mikroskopu

• Fyzikální podstata vzniku obrazu v mikroskopu
• Ernst Abbe (1873) pomerne složitá teorie,
  založená na využití Huygensova principu a
  interferenci transformovaných svetelných vln
  procházejících preparátem

26
Zvetšení svetelného mikroskopu

• Zvetšení objektivu x zvetšení okuláru

27
Zvetšení svetelného mikroskopu

• Maximální užitecné zvetšení
• Závisí na rozlišovací schopnosti objektivu

28
Rozlišovací schopnost svetelného mikroskopu

• Vzdálenost dvou bodu, které mikroskop zobrazí
  jako dva samostatné body
• a 0,61 l/ n x sina
• l - vlnová délka
• n index lomu prostredí pred objektivem
• a - polovina otvorového úhlu kužele paprsku,
  které mohou vstoupit do objektivu

• Rozlišovací schopnost lze zvýšit
• snížením ? ? použití modrého svetla (modrý filtr)
  
• zvyšováním n ? ? použití imerzního oleje

29
Rozlišovací schopnost svetelného mikroskopu
vzdálenost dvou bodu, jež jsme schopni vnímat
samostatne oko asi 0,25mm U mikroskopu odpovídá
polovine vlnové délky použitého zárení cca. 0,2
µm Svetelný mikroskop 1000 x víc než oko
30
Zvetšení svetelného mikroskopu

• Maximální užitecné zvetšení
• Závisí na rozlišovací schopnosti objektivu

31
Okuláry
Objektivy
Stolek
Hlavní vypínac
Kondenzor
Regulace osvetlení
Makro a mikrošroub
Krížový posun
Zdroj svetla
32
Preparát c. 2 NAKRESLIT!!! Paramecium caudatum

• Zvetšení

33
Typy objektu

• Amplitudové zbarvené objekty absorbující svetlo
  - rovnomerne ruzné cásti svetelného spektra,
  jeví se jako tmavé
• - ruzne, jeví se jako barevné
• Fázové nebarevné objekty, lišící se indexem
  lomu a tlouštkou
• Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátu
• - optickými metodami

34
Barvení preparátu
Nativní Živé bunky nutno použít vhodný fyziol.
roztok (savci a ptáci 0,85, obojživelníci
0,64, pufrovaný fyz. roztok PBS...) možno
barvit vitálne karmín potravní
vakuoly mitotracker mitochondrie metylénová
modr odlišení živých a mrtvých bb, živé se
neobarví
Trvalé Musí se fixovat proti posmrtným zmenám
bb a tkání pri zachování barvitelnosti denaturací
bílkovin se zpevní a zakonzervují bb struktury

• Roztery
• Suchý r. fixace po zaschnutí (methanol), 2D
  objekty
• Vlhký r. fixace za vlhka (Bouin-Holland,
  sublimát, aj.), 3D objekty

• Celkové preparáty
• Kus tkáne
• Malý živocich (fix. Alkohol 70-80 ci formaldehyd
  4

Typy barviv pH kyselá eosin, svetlá zelen,
kyselý fuchsin, kyselina pikrová
zásaditámetylénová modr, toluidinová modr,
bazický fuchsin neutrální Giemsa-Romanowski,
ruzné formy stríbra objekt barvení motolice a
tasemniceborax-karmín prvoci
Giemsa-Romanowski, protargol, hematoxylin tkáne
hematoxylin-eosin
35
Nativní preparát Tetrahymena pyriformis karmín
Trvalé preparáty Tetrahymena pyriformisopálová
modr Trypanosoma carassiGiemsa-Romanowski
Tritrichomonas foetusGiemsa-Romanowski
36
Trvalé barvení Suchý rozter Trypanosoma
carassi Tritrichomonas foetus
pro barvení Giemsa-Romanowski
cca 45
37
Trvalé barvení Giemsa-Romanowski Trypanosoma
carassiTritrichomonas foetus

• Fixáž methanol 3
• Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski
  (Sigma) 20-60
• Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1
• Po oschnutí pozorování preparátu

38
Preparát c. 3 Trypanosoma sp.
39
Preparát c. 4Tritrichomonas foetus
40
Trvalé barvení Giemsa-Romanowski Trypanosoma
carassiTritrichomonas foetus

• Fixáž methanol 3
• Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski
  (Sigma) 20-60
• Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1
• Po oschnutí pozorování preparátu

41
Preparát c. 5 Tetrahymena pyriformis

• Barvení karmín

42
Trvalé barvení Giemsa-Romanowski Trypanosoma
carassiTritrichomonas foetus

• Fixáž methanol 3
• Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski
  (Sigma) 20-60
• Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1
• Po oschnutí pozorování preparátu

43
Trvalé barvení Giemsa-Romanowski Trypanosoma
carassiTritrichomonas foetus

• Fixáž methanol 3
• Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski
  (Sigma) 20-60
• Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1
• Po oschnutí pozorování preparátu

44
Imerzní olej
45
Imerzní olej

• Predejdeme ztrátám svetla
• Do objektivu dopadne vetší množství paprsku
• Obraz obsahuje víc detailu

46
Imerzní olej
47
Preparát c. 6 NAKRESLIT!!! Tetrahymena
pyriformis

• Barvení opálová modr
• Zvetšení

cytostom
rasinkové rýhy
vakuola
48
Preparát c. 7 NAKRESLIT!!! Trypanosoma carassi

• Barvení Giemsa-Romanowski
• Zvetšení

jádro
kinetoplast
undulující membrána
49
Preparát c. 8 NAKRESLIT!!! Tritrichomonas
foetus

• Barvení Giemsa-Romanowski
• Zvetšení