V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung

1
V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung anschaulich
betrachtet

• Beispiele für Protein-Liganden Komplexe
• Wo ist das aktive Zentrum?
• (Docking wird hier nicht behandelt siehe
  Spezialvorlesungen von A. Kämper und A.
  Hildebrandt/D. Neumann im SS05)
• Wie stark binden Liganden an Proteine?
• Wie kann man die Affinität des Liganden
  verbessern?

2
beta-TrypsinBenzamidin (3ptb)
Enge, sehr polare Bindungstasche auf
Proteinoberfläche.
Amidin-Gruppen des Liganden bilden 4 H-Bindungen
mit Carboxylgruppen des Proteins (Trypsin)
aus. Benzolring passt optimal in hydro-phobe
Tasche.
www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock
3
Cytochrome P450cam Kampher (2cpp)
Weites, recht unpolares aktives Zentrum im
Proteininneren. Hämgruppe katalysiert Reaktion.
Partielle Desolvatation. Wie gelangt Substrat
hinein?
www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock
4
Maus-Antikörper McPC-603Phosphocholine (2mcp)
Bindungstasche auf Proteinoberfläche wird durch
drei hypervariable Loops geformt.
www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock
5
StreptavidinBiotin (1stp)
Sehr polare, tiefe Bindungstasche. Außerordentlich
starke Affinität.
www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock
6
HIV-1 ProteaseXK-263 Inhibitor (1hvr)
Inhibitor XK-263 stammt von Merck-Dupont. Er
enthält eine 7-Ring zyklische Urea-Einheit mit
Phenyl- und Naphtyl-Ringen. Die CO-Gruppe ahmt
das ansonsten konservierte Wassermolekül 301 nach
und verdrängt es. Der tiefere Teil des zyklischen
Urea-Rings enthält zwei benachbarte
Hydroxylgruppen, die H-Bindungen mit den
katalytischen Aspartat-Residuen bilden.
www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock
7
Identifikation von funktionellen Residuen

• 1 Funktionelle bzw. katalytische Residuen werden
  traditionell in (hoch) konservierten Regionen von
  Multiple Sequence Alignments erwartet
• evtl. Kopplung mit Information über 3D-Struktur
• 2 finde Residuen, die Proteinstruktur
  destabilisieren.
• Grund Funktionelle Residuen im Proteininneren
  sind oft energetisch ungünstig. Funktionalität
  auf Kosten von Stabilität.
• 3 finde Löcher oder Einbuchtungen in
  Proteinstruktur.
• Hier vorgestellt integrierte Methode, die 1 -3
  implementiert. Möglichkeit für funktionelle
  Annotation von Proteinen mit unbekannter Funktion.

8
Wo ist das aktive Zentrum I?

• Auswahl von 49 Enzymen. Kriterien
• - Auflösung ? 2.0 Å
• - funktionelle Residuen sind bekannt (in
  Swissprot-Eintrag in ACT_SITE)
• - enthalten nur eine Domäne (SCOP Datenbank)
• - die SCOP-Einträge sind unterschiedlich
• - es gibt ? 10 homologe Sequenzen mit Blast
  E-Wert lt 10-10.
• 98 katalytische Residuen
• 22 His
• 17 Asp, Glu
• 10 Cys
• 8 Ser
• 7 Arg, Lys Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol
  Biol 327, 1053 (2003)
• 5 Tyr
• 3 Asn
• 2 Thr

9
Repräsentative Enzyme

• PDB Protein Länge Auflösung EC
  Zahl Zahl und Namen der
• SCOP Seq. katalytischen
  Residuen

10
Repräsentative Enzyme
11
Fitness-Funktion

• - Bewertung der Seitenketten-Konformation
  entsprechend Rotamer-Bibliothek
• - Seitenketten-Packung (wissensbasiert)
• - Hydratation (wissensbasiert)
• Analyse der Proteinoberfläche (MSP-Programm)
  Zuordnung zu den einzelnen Residuen
• - elektrostatische Energie AMBER-Partialladungen
  ? elektrostatisches Potential (aus
  Poisson-Boltzmann-Rechnung)
• Jeder Score(S), Rang (R) und Position (L) werden
  gegen den Mittelwert und die Standardabweichung
  für jeden Aminosäuretyp normalisiert.
• Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327,
  1053 (2003)

12
Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen

• Beispiel 3D-Profil für Lysozym aus
  Hühnereiweiss. D52 ist katal. Residue.
• native Hydratations- lokale D52 hat sehr
  schlechten Rang. D.h.
• Residue klasse Struktur es wäre
  günstig D52 zu ersetzen.
• Katalytische Residuen sind stets un-
• stabiler als nicht-katalytische.

Score Rang Score native native
beste Residue Residue Residue
Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053
(2003)
13
Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen

• Flussdiagramm der Vorhersagemethode.
• - Links oben Analyse der Konservierung.
• - Rechts oben Analyse der Position in
• 3D-Struktur bzw. Stabilität der
• Mutantenproteine
• - untere Hälfte trifft für verschiedene
• Aminosäuretypen (1-Letter-code)
• die Entscheidung, ob katalytische
• Residuen vorliegen.

Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053
(2003)
14
Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen

• Proteinstrukturen mit unbekannter Funktion. Die
  vorgeschlagenen katalytischen Residuen sind
  markiert.

Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053
(2003)
15
Wo ist das aktive Zentrum II

• Analyse mit elektrostatischen Kontinuumsrechnungen
  
• Die Titrationszustände der meisten Aminosäuren
  folgen der
• Henderson-Hasselbalch-Gleichung.
• Berechne Titrationskurven für 3 Enzyme mit UHBD.
• TIM und AR haben eine sehr ähnliche Strukturen,
  katalysieren aber ganz unterschiedliche
  Reaktionen.
• AR und PMI haben sehr verschiedene Strukturen,
  katalysieren aber ähnliche Reaktionen.

Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001)
16
Theoretische Titrationskurven

• Titrationskurven aller His-Residuen in TIM

Triosephosphat Isomerase (TIM) katalysiert die
Isomerierung von D-Glyceraldehyd- 3-Phosphat zu
Dihydroxyaceton-Phosphat. Man findet 4 Residuen
mit verschobenen, flachen Titrationskurven His95,
Glu165, Lys112, Tyr164. Davon liegen H95, E165
und Y164 eng beieinander.
Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001)
17
Theoretische Titrationskurven

• Titrationskurven aller Tyr-Residuen in AR

Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001)
Aldose-Reduktase (AR) katalysiert die Reduktion
einer Aldehydgruppe von Aldose zu einem
Alkohol. Man findet 7 Residuen mit verschobenen,
flachen Titrationskurven Tyr48, Cys298, Glu185,
Lys21, Lys77, Tyr107, Tyr209. Tyr48, His110 und
Cys298 bilden das aktive Zentrum. Die anderen
Residuen liegen in der Nähe.
18
Theoretische Titrationskurven

• Titrationskurven aller Lys-Residuen in PMI

Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001)
PMI katalysiert die Interkonversion von
Mannose-6-Phosphat und Fructose-6- Phosphat. Man
findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen
Titrationskurven His135, Lys100, Lys136,
Tyr287. Alle liegen eng beieinander, die ersten 3
wohl im aktiven Zentrum und His135 nahe bei
Lys136.
19
Weitere Beispiele
PDB ID Name Chemie Residuen mit auffälligen
Titrationskurven
1AMQ Aspartat H189, Y225, K258, R266, C191,
C192, aminotransferase Transamination
Y256, Y295, H301 1CSE Subtilisin
Peptidhydrolyse D32, H64 Carlsberg
(Serin-Protease) 1EA5 Acetylcholinesterase
Ester Hydrolyse Y130, E199, E327, H440, D392,
Y148, H398, H425 1HKA
6-Hydroxymethyl- Kinase D97, H115
7,8-dihydropterin pyrophosphate kinase 1OPY
3-Keto-?5-Steroid Isomerase Y16, Y32, Y57,
C81 isomerase 1PIP Papain
Peptidhydrolyse C25, H159, (Cys
Protease) K17, K174, Y186, R59, R96 1PSO
Pepsin Peptidhydrolyse D32, D215, D303,
D11 (Säure-Protease) 1WBA Winged bean
Speicherung - keine keine albumin Enzymfunkti
on
Residue im zweiter Schale.
Residue im aktiven Zentrum
Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001)
20
Fazit

• Mittels elektrostatischer Kontinuumsrechnungen
  für bekannte Kristallstrukturen von Proteinen
  wurde für verschiedene externe pH-Werte die
  energetisch optimale Gesamtladung der Proteine
  berechnet.
• Aktive Zentren von Enzymen enthalten oft mehrere
  polare bzw. geladene Seitenketten um die
  chemische Umwandlung zu katalysieren.
• Deren Titrationszustände sind eng aneinander
  gekoppelt und zeigen im Vergleich zu isolierten
  Seitenketten sehr ungewöhnliche Titrationskurven.
• Diese Methode erlaubt also die Position von
  aktiven Zentren allein aufgrund der
  Proteinstruktur zu erkennen.

Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001)
21
Wie stark binden Liganden an Proteine?

• Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

22
exp. Affinitäten von ProteinLiganden Komplexen
Atome Ligand Target Typ    -log K1
1 Ca2 Amino-transferase IM 6.70 IM
Metallionischer Inhibitor 1 Hg2
Uroporphy-synthase IM 6.00 1 Mn2
Inositol-phosphatase IM 5.70 1 Fe3
Hydroxylase IM 5.30 1 Ag Arylformamidase
IM 5.00 1 F-   Phosphotransferase IA
4.55 IA kleiner anionischer Inhibitor 1 S2-  
Peroxidase IA 4.28 1 Xe Myoglobin L
2.30 L Ligand (Agonist oder Antagonist) 1 NH3
Meamine glutamate transferase I 1.79 I
Inhibitor 2 CO Myoglobin L 7.52 2
O2 Myoglobin L 6.18 2 Cyanide Methane
oxygenase IA 6.00 2 Hydroxylamine Glycerol
oxidase IC 5.92 IC potentiell kovalente
Wechselwirkung 3 Azide Glycerol oxidase IA
5.70 3 Ethylamine Protease I I 3.00 4
Thioacetamide Methan monooxygenase I 5.00 4
NO3-   Carbonate deydratase IA 4.70 4
Vanadate Phytase IA 4.55 5
Thiosemicarbazide Methane monoo xygen. I 6.00
5 SO42-   Creatine kinase IA 5.22 5
Iodoacetamide Methyl transferase IC 5.00 6
Putrescine Spermine synthase I 8.77 6
Aminooxyacetic acid Aminotransferase I 7.19
6 Oxalat Lactate dehydrogenase IA 5.80 7  
  ?-Aminobutyid acid Neuromanidase transmitter
L 8.00 7 L-Cysteine Serine acetyl
transferase I 6.22 7 Aminomethiozolidine
Methyl transferase I 5.40 8 Muscimol  
  ?-aminobutylicacid agonist L 8.73 8
Bromopyrimidone Cytosine deaminase I 6.24 8
Phosphonoacetic acid DNA polymerase I 6.00 9
Acetopyruvate Acetoacetate decarboxylase I
7.00 9 Methyl iodotyrosine Tyrosine
monooxygenase I 6.30 9 Nitrooxazolidinone
Aldehyde dehydrogenase I 5.46 9 Benzamidine
Trypsin I 4.77
23
experimentelle Protein-Liganden Affinitäten
Atome Ligand Target Typ    -log K1
10 Allopurinol Xanthine oxidase I 9.17
10 Acetylcholine Cholinergic receptor L
8.14 10 Cabachol Cholinergic receptor L
7.85 11 Mercapto oxoglutaric Isocitrate
dehydrogenase I 8.30 11 Diethyl
pyrocarbonate Ca2 transmitter L 8.80 11
Dopamine    ,   ?,? -androgen receptor L
8.65 12 Norepinephrine Adrenergic agonist L
8.88 12 Nicotine Nicotinic receptor L
8.22 12 Hydroxybenzyl-Me3NR4 Acetycholiesterase
I I 7.68 13 Tiamenidine     ?-Adrenergic
agonist L 8.66 13 Serotonin 5-Hydroxy
tryptamine receptor L 8.30 13 Benzyl
mercaptopropionate Carboxypeptidase I 7.96 14
Guanabenz     ?-Adrenergic receptor L
9.02 14 Methylenpenicillanic     ?-Lactamase
I 8.85 14 Captopril Carboxypeptidase I
8.70 15 Aminoclonidine L 9.32 15
Guanfacine     ?-Adrenergic agonist L
8.73 15 Isatin derivative Rhino protease I
7.30 16 Acetophenone derivative ACEsterase IC
14.89 16 Biotin Streptavidin L 13.43 16
Naphazoline Adrenergic L 8.73 17
Melatonin Melatonin receptor L 8.96 17
Guanine derivative Purine nucleoside
phosphorylase I 7.96 17 piperoxan antihyper.
receptor L 7.85 18 Iodomelatonin Melanin
receptor L 10.68 18 Alprenolol    
?-adrenergic receptor L 9.47 18
Phosphoramidon Metalloproteinase I 7.55 19
Vesamicol Vesamicol receptor L 9.47 19
Propranolol     ?-adrenergic receptor L
9.39 19 Trimethopri der Dihydrofolate reductase
I 8.53 20 Estradiol Steroid receptor L
9.69 20 Melatonin derivative Melatonin receptor
L 9.68 20 Vesamicol derivative Vesamicol
receptor L 9.20 21 2-Carboxyl arabinitol
bisphosphate Ribulose carboxylase I 12.72 21
4-Carboxyl arabinitol bisphosphate Ribulose
carboxylase I 10.55 21 Triprolidine Histamine
antagonist L 9.98 21 Trimethoprim
dihydrofolate reductase I 8.44
Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)
24
experimentelle Protein-Liganden Affinitäten
Atome Ligand Target Typ    -log K1
22 Amitriptylinoxide Antidepressant L
9.02 22 Mazindol derivative Dopamine
transporter L 8.82 22 Indolyl ethyl
amines 5-Hydroxy tryptamine receptor L
8.49 22 Isatin derivative Rhino protease I
8.00 23 Vesamicol der. VR L 11.05 23
Neuraminic acid der. Sialidase I 10.52 23
Melatonin der. melamin receptor L 10.24 23
Vesamicol der. VR L 10.17 24 Vesamicol der.
VR L 11.19 24 Isatin der. Rhino protease
I 8.70 24 Methadone Narcotic L 8.66 25
Melatonin der. Melamin receptor L 9.62 25
Corticosterone Steroid receptor L 8.51 25
Isatin der. Rhino protease I 8.40 26
Aldosterone Steroid receptor L 9.32 26
Haloperidol Antipsychotic L 9.02 26
Yohimbine     ?-2 adrenergic receptor L
8.73 26 Isatin der. Rhino protease I
8.40 27 Vesamicol der. VR L 9.74 27
Dexetimide Anticholinergic L 8.80 27
Dehydrosinefungin mRNA Me trans. I 8.74 28
Vesamicol der. VR L 9.82 28 Indoyl ethyl
amines 5-Hydroxy tryptamine receptor L
9.70 28 Prazosin     1-adrenergic agonist L
9.62 29 Spiperone L 10.27 29 Ketanserin
Serotonin antagonist L 9.39 29
Dextromoramide Analgesic L 9.02 30
Peptide phosphonates Carboxy peptidase IM
12.00 30 Domperidone Dopamine antagonist L
10.13 30 Etorphine Narcotic L 9.91
Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)
25
experimentelle Protein-Liganden Affinitäten
Atome Ligand Target Typ    -log K1
31 Carboxamide derivative 5-Hydroxy
tryptamine receptor L 9.54 31
Benzodiazepine derivative Integrin antagonist L
8.60 31 Budesonide Glucocorticoid
receptor L 8.54 31 Flavin mononucleotide
Cytochrome b reductase I 8.10 32
Serotonin dimer 5-Hydroxy tryptamine receptor L
9.34 32 Cyclic urea HIV protease I 8.85
32 Hoechst 33258 DNA L 7.41 33
Methotrexate Dihydrofolate reductase I 9.70
34 Cyclic-aza isostere HIV protease I 10.21
34 Buprenorphine narcotic L 9.83 34
Pimozide antipsychotic L 9.39 34 Hoechst
33342 DNA L 7.44 35 Peptide phosphonates
Carboxypeptidase IM 11.52 35 Argatroban
Thrombin I 7.72 35 Peptide derivative
Thermolysin I 7.29 36 Cyclic-aza isostere
HIV protease I 10.15 36 Benzodiazepines
Integrin L 8.55 36 Cyclic urea HIV
protease I 8.37 37 Peptide phosphonates
Carboxypeptidase IM 11.40 37 Cyclic-aza
isostere HIV protease I 9.31 37
Benzodiazepines Integrin L 8.80 38
Hydroxypyrone HIV protease I 10.22 38
Cyclic urea HIV protease I 9.92 38
Benzodiazepines Integrin L 8.40 39
Cyclic sulfone HIV protease I 9.52 39
Benzodiazepines Integrin L 7.05 40
Cyclic-aza isostere HIV protease I 11.30 40
Hydroxy pyrone HIV protease I 11.16
Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)
26
experimentelle Protein-Liganden Affinitäten
Atome Ligand Target Typ    log K1
41 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM
12.00 41 Cyclic urea HIV protease I 9.48
41 Cyclic sulfone HIV protease I 9.22 42
Hydroxypyrone HIV protease I 11.10 42
Cyclic urea HIV protease I 9.85 43
Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM
13.96 43 Cyclic urea HIV protease I
9.48 43 Cyclic sulfone HIV protease I 9.00
44 Cyclic urea HIV protease I 10.41 45
Serotonin dimer 5-Hydroxy tryptamine receptor L
10.05 46 Cyclic urea HIV protease I 10.75
46 Cyclic urea HIV protease I 9.51 47
Zaragozic acid A Squalene synthase I 10.11
48 Cyclic urea HIV protease I 10.35 50
Cyclic urea HIV protease I 10.20 50
Hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I
7.85 51 Zaragozic acid B Squalene synthase I
10.54 51 Combichem hydroxyethyl amine
derivative Cathepsin D I 8.05 52 Cyclic urea
HIV protease I 9.37 54 Cyclic urea HIV
protease I 10.57 54 Combichem hydroxyethyl
amine derivative Cathepsin D I 7.23 55
Peptide-based Thrombin receptor L 7.40 56
Cyclic urea HIV protease I 10.37 56
Peptide-based Thrombin receptor L 7.92 58
Cyclic urea HIV protease I 10.96 60 Cyclic
urea HIV protease I 10.80 62 Cyclic urea
HIV protease I 10.62 64 Cyclic urea HIV
protease I 10.07 64 Acetyl-CoA Acetyl-CoA
carboxylase I 8.00 67 Peptide-based
Thrombin receptor L 8.10 68 Stearyl-CoA
Acetyl-CoA carboxylase I 8.89
Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)
27
Bindungsaffinität

• ? Metallionen oder Metalloenzyme
• ? kleine Anionen
• ? natürliche Liganden
• Enzyminhibitoren
• linearer Anstieg der freien Bindungsenthalpie zu
  Beginn
• bis ca. 15 Nicht-H-Atome
• ??Gbinding - 60 kJ mol-1 maximal.
• Dann wird Sättigung beobachtet.

Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)
28
Interpretation
Metallionen und Anionen binden am stärksten.
Nanomolekulare Liganden können bereits mit 7-10
Atomen erreicht werden. Grössere Liganden -
besitzen üblicherweise nur eine kleine Zahl
polarer Atome pro Molekül - die elektrostatischen
Gruppen der Bindungsstelle werden zunehmend im
Inneren begraben - sind oft elektrisch neutral -
besitzen mehr entropische Freiheitsgrade
-??G pro Atom
Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)
29
Wie kann man die Bindungsaffinität verbessern?

• Es gibt 2 Strategien zum Design von stark
  bindenden Inhibitoren
• (a) kombinatorische Strategien
• (b) rationale Strategien.
• Beide Strategien erlauben es in der Praxis
• effizient Lead-Moleküle mit geringer Affinität zu
  finden
• beide sind ineffizient und unzuverlässig,
  Liganden mit hoher Affinität zu finden (nM).
• Anwendung der kombinierten Strategie CombiSMoG um
  Ligand für menschliche Carbonic Anhydrase II
  (HCA) zu finden.
• Resultat Es wurde der stärkste bisher bekannte
  Ligand für HCA gefunden
• ( Kd 30 pM).

Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)
30
CombiSMoG

• Analyse von 1000 Protein-Liganden Komplexe in PDB
  
• ? entwickle statistisches Potential zwischen
  Atomen des Liganden und des Proteins
• Kontakt ja, wenn Distanz lt 5 Å
• Vorteile gegenüber Molekülmechanik-Kraftfeldern
• (1) sehr schnell auszuwerten
• (2) Potentialwerte beinhalten implizit die
  Entropie für Wasserdesolvatation, entsprechen
  freien Bindungsenthalpien
• (3) Potential ist typisch für Protein-Liganden-Wec
  hselwirkungen

Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)
31
CombiSMoG-Algorithmus
Dunkelgrünes Fragment wird in Bindungstasche
positioniert. Weiteres Fragment aus einer
Bibliothek mit 100 organischen Substanzen (blau)
wird angefügt. Winkel wird in 60
Schritten optimiert. Fragment wird akzeptiert,
wenn neuer Gesamt-Score besser als der alte ist
bzw. entsprechend einer Monte-Carlo- Zufallsentsc
heidung. Die Suche nach weiteren Fragmenten
wird fortgesetzt bis Abbruchbedinung erreicht
wird (z.B. maximale Anzahl an Nicht-H-Atomen
erreicht, z.B. 30).
Methode kann 50.000 Strukturen pro Tag generieren.
32
kombinatorisches Liganden-Design
Strukturen der 5 Liganden mit den besten
Scores. In Klammer die Bewertung nach Optimierung
mit dem CHARMM-Kraftfeld. Die lila und
hellblauen Moleküle wurden synthetisiert und
ihre Kristallstruktur mit HCA bestimmt.
Geeignetes Startfragment mit KD 120 nM um
WW mit Zink-Ion zu vermeiden. (H2NO2S-Gruppe hat
Kontakt mit Zn2).
33
Spektakulärer Erfolg für theoretisches
Liganden-Design
Vorhergesagte Orientierung der R- und
S-Stereoisomere In gelb ist jeweils
die Kristallstruktur gezeigt. Oben und unten in
B sind zwei verschiedene Ansichten gezeigt.
34
Korrelation von CombiSMoG Scores mit exp. Daten
Korrelation für Inhibitoren von HCA, 80 Liganden
für für die Kristallstrukturen vorliegen asp
Aspartic Protease met Metalloproteine m
isc ser Serin-Proteasen sug
Zucker-bindende Proteine
35
Welche Aminosäuren bestimmen Substratspezifität?

• Phosphorylierung ist zentraler Bestandteil vieler
  Signaltransduktionsketten.
• Proteinkinasen katalysieren Phosphoryltransfer.
• - ca. 2 von eukaryotischen Genomen kodieren für
  Proteinkinasen.
• - Im Mensch gibt es wohl 518 verschiedene
  Proteinkinasen.
• Wie kann hohe Substratspezifität erreicht werden?
• (a) Lokalisation in unterschiedlichen
  Zellkompartments,
• (b) selektive Aktivierung durch Kofaktoren (z.B.
  CDK)
• (c) Spezifität des aktiven Zentrums bzw. von
  Substratbindungspositionen für Bindung bestimmter
  Liganden

Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)
36
prokaryotisches Zweikomponentensystem
rot und cyan 2 katalytische Proteinkinase-Unter
einheiten Dimerisierung via Helices PO4 Gruppe
wird zunächst von ATP auf konserviertes His in
Dimerisierungs-Domäne übertragen blau und
magenta Regulatorprotein. Transfer der PO4
Gruppe auf Asp
Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)
37
Spezifizität bestimmende Residuen
MSA Gruppierung nach Proteinfamilien HK1, HK2,
HK3, die jeweils die gleichen Substrate besitzen.
Welche Residuen machen die Unterschiede
aus? Das konservierte Arg (lila) ist keine
spezifitätbestimmende Residue, die roten und
blauen Spalten sind dagegen gute Kandidaten.
Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)
38
Eukaryotische Proteinkinase
Phospho-Thr197
gelbes Substratpeptid liegt zwischen den beiden
Domänen (rot und blau) der Protein- kinase. In
(b) (d) sind die möglichen spezifitätsbestimmend
en Residuen als raumfüllende Modelle gezeigt.
Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)
39
Numerische Analyse
Definiere
Ii
I
i Position im Alignment x Aminosäuretyp y Nummer
der Familie in einem Alignment Pi(x,y) ist
Wahrscheinlichkeit, Aminosäure vom Typ x an
Position i in der Familie y zu finden. Pi(x)
ist die gleiche Wkt, wobei der Typ der Famile
egal ist P(y) ist der Anteil aller Proteine, der
zu Familie y gehört.
Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)
40
Eine konkrete Studie an einem biologischen System
oft kommt es anders als man denkt.

• Gu, W., Kofler, W., Antes, I., Freund, C., Helms,
  V. (2005) Biochemistry, 44, 6404-6415.
• Alternative Binding Modes of Proline-rich
  Peptides Binding to the GYF-Domain.

41
Why are proline-rich sequences special?

• Repetitive proline-rich sequences are found in
  many proteins and in many cases are thought to
  function as docking sites for signaling modules.
• Why might proline be singled out for recognition
  by so many key protein-protein interaction
  modules?
• Several features of proline distinguish it from
  the other 19 naturally
• occurring amino acids (Fig. 1A)
• the unusual shape of its pyrrolidine ring
• the conformational constraints on its dihedral
  angles imposed by
• this cyclic side chain
• its resulting secondary structural preferences
• its substituted amide nitrogen,
• and the relative stability of the cis isomer in
  a peptide bond.
• Each recognition domain exploits some combination
  of these distinctive features of proline in order
  to achieve specific binding to proline-rich
  regions.

Zarrinpar, A., Bhattacharyya, R. P., and Lim, W.
A. (2003) The structure and function of proline
recognition domains, Sci. STKE. RE8.
42
Properties of PPII helices

(B) Schematic and structural representation of a
PPII helix. The helix has twofold pseudosymmetry
A rotation of 180 about a vertical axis leaves
the proline rings and the carbonyl oxygens at
approximately the same position. The Protein Data
Bank (PDB) accession code for the
poly-(l)-proline structure shown is 1CF0. (C) A
view down the axis of the PPII helix highlighting
the position of the carbons in the xP dipeptide.
In the x position that requires C-substitution
(blue), the primary recognition element is the ß
carbon, whereas in the P position that requires
N-substitution (red), the primary recognition
element is the d carbon that is unique to proline.
Zarrinpar, A., Bhattacharyya, R. P., and Lim, W.
A. (2003) The structure and function of proline
recognition domains, Sci. STKE. RE8.
43
Structure and binding mechanism of SH3 domains

structure of the Sem5 SH3 domain cartoon of the
proline-binding surface in complex with a
proline-rich ligand (1SEM). Core recognition
surface yellow two xP binding grooves
formed by aromatic amino acids green
less conserved specificity pockets
Zarrinpar, A. et al. (2003)
44
Structure and binding mechanism of WW domains

1EG4 Core recognition surface yellow xP
binding groove formed by aromatic amino
acids green less conserved specificity
pockets.
Zarrinpar, A. et al. (2003)
45
Structure and binding mechanism of EVH1 domains

1EVH Core recognition surface yellow
conserved set of aromatic residues system
is different from other PRS-binding domains
Zarrinpar, A. et al. (2003)
46
Structure and binding mechanism of a GYF domain

1L2Z Core recognition surface yellow xP
binding groove formed by aromatic amino
acids green less conserved specificity
pockets.
Zarrinpar, A. et al. (2003)
47
Identification of a novel register-shifted
binding mode
NMR structure of GYF domain with wild-type
peptide. The GYF domain is represented by its
molecular surface the peptide atoms are drawn as
sticks. Residues forming the binding pocket are
coloured in dark grey and labelled by their
one-letter codes and sequence numbers.
Gu et al. Biochemistry, in press (2005)
48
What is the conformation of the unbound peptide
Gu et al. Biochemistry, in press (2005)
49
Study conformation of unbound peptide
Evolution of the backbone dihedral angles (black
Phi angles red Psi angles) during the MD
simulation of the wild-type peptide (a) and the
mutant peptide (b). Ideal values of the dihedral
angles are shown in solid lines (blue Phi
angles green Psi angles).
Gu et al. Biochemistry, in press (2005)
50
Unbound peptides have PPII helical conformation
Superposition of the representative conformations
of simulations of unbound peptides (from left to
right WT, WTE, G8W and H9M) onto the bound
peptide in the NMR structure. Representative
conformations are colored in black while the
bound peptide in the NMR structure is shown in
grey.
Gu et al. Biochemistry, in press (2005)
51
Which residues are crucial for binding?
Substitution analysis of the SHRPPPPGHR peptide
binding to the GYF domain. All single
substitution analogues of the peptide were
synthesized on a cellulose membrane. The single
letter code above each column marks the amino
acid that replaces the corresponding wild-type
residue, while the row defines the position of
the substitution within the peptide. Spots in
the most left column (WT) have identical
sequences and represent the wild type peptide.
The membrane was incubated with a GST-GYF
construct of CD2BP2. Bound protein was detected
with an anti-GST primary antibody and a
horse-radish peroxidase coupled secondary
antibody. The relative spot intensities correlate
qualitatively with the binding affinities
Conclusion Two central prolines are critical and
the following glycine. But can this glycine be
mutated to Trp?
Gu et al. Biochemistry, in press (2005)
52
Binding analysis of Trp-peptide mutant
Binding analysis of the CD2BP2-GYF domain to the
peptide SHRPPPPWHRV in comparison to the
wild-type peptide SHRPPPPGHRV by NMR. (a) The sum
of the weighted geometrical differences of the
chemical shifts (Geometric sum of chemical shift
changes) for assigned peaks, which could be
identified at all applied peptide concentrations
is plotted against the concentration of the
peptide. (b) Mapping of the binding site of
SHRPPPPGHRV and SHRPPPPWHRV peptides onto the
CD2BP2-GYF domain. Overlay of HSQC spectra of GYF
domain alone (green) and GYF-domain in the
presence of a 10-fold excess of the wild-type
peptide SHRPPPPGHRV (blue) or the mutant peptide
SHRPPPPWHRV (red), respectively.
Gu et al. Biochemistry, in press (2005)
53
MD simulation of GYFdomain complexes
Comparison of the binding interfaces of the GYF
domain (NMR and simulation) for the wild-type
complex (above) and of the H9M mutant (below).
The GYF domain is represented by its molecular
surface and coloured by position (from orange to
deep blue completely buried to completely
exposed) the peptide atoms are drawn as sticks
and coloured according to their appearance in
sequence.
Gu et al. Biochemistry, in press (2005)
54
Trp-peptide mutant shows register shift
(a) Superposition of the two binding modes found
in the simulation of the G8W mutant complex
(starting from the docking results). The two
conformations of the peptide are drawn as sticks
(blue mode 1, red mode 2, pink Pro6 and Pro7
in mode 1, yellow Pro6 and Pro7 in mode 2). (b)
Binding mode of the G8R mutant complex
(representative conformation of the simulation).
The peptide atoms are represented by sticks and
coloured according to their sequence number. In
(a) and (b), the GYF domain is represented by its
molecular surface and coloured by position (from
orange to deep blue completely buried to
completely exposed) and Pro6 and Pro7 are
labelled by their one-letter codes and sequence
numbers. Mode 2 is labelled as (alt). (c)
Superposition of the representative conformations
of the five simulations of wild type GYF complex
starting from the alternative binding mode. Pro6
and Pro7 are represented by sticks and are
labelled by their one-letter codes and sequence
numbers. Pro6 is coloured in light grey and Pro7
is coloured in dark grey. (d) The translation and
rotation motions of the peptide between the two
binding modes (blue mode 1, red mode 2, pink
Pro4 to Pro7 in mode 1, yellow Pro4 to Pro7 in
mode 2). For Pro4 to Pro7 a rotation is the
principle component of motion, while for other
residues in the peptide a translation is the
principle component of motion.
Gu et al. Biochemistry, in press (2005)
55
register-shift hypothesis supported by experiments
Substitution analysis of the SHRPPPPWHR peptide
binding to the GYF domain. All single
substitution analogues of the peptide were
synthesized on a cellulose membrane. The single
letter code above each column marks the amino
acid that replaces the corresponding wild-type
residue, while the row defines the position of
the substitution within the peptide. Spots in the
most left column (WT) have identical sequences
and represent the wild type peptide. The membrane
was incubated with a GST-GYF construct of CD2BP2.
Bound protein was detected with an anti-GST
primary antibody and a horse-radish peroxidase
coupled secondary antibody. The relative spot
intensities correlate qualitatively with the
binding affinities
Gu et al. Biochemistry, in press (2005)
56
Summary

• Complexes of adaptor domains with proline rich
  sequences form an important cellular network
• Specificity of interactions vs. Multiplicity of
  interactions.
• Interactions can be influenced by proline
  conformation (cis/trans)
• Binding modes may not correspond to simple rigid
  body docking
• (see register shift)

57
Zusammenfassung

• Die ProteinLiganden Wechselwirkung ist
  heutzutage relativ gut verstanden.
• Wir haben Tools kennengelernt, mit denen man
• die Position des aktiven Zentrums lokalisieren
  kann
• Bindungsaffinitäten abschätzen bzw. verbessern
  kann
• die Assoziation bzw. Dissoziation des Liganden
  simulieren kann.
• Für die Zukunft bleibt
• (1) korrelierte Analysen aus der umgekehrten
  Richtung finde einen Liganden, der selektiv an
  ein bestimmtes Protein bindet, jedoch nicht an
  andere
• (2) Automatisierung Verknüpfung der obigen
  Schritte
• (3) Einbeziehung zusätzlicher Gesichtspunkte
  (ADMET)