Analisi isotopica

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Analisi isotopica
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Tecniche isotopiche

• Le tecniche isotopiche sono state sviluppate
  allinizio degli anni 80 in Francia (Università
  di Nantes) e hanno avuto grande applicazione in
  tutti i campi della ricerca scientifica.
  Attualmente sono in grande espansione grazie
  allintroduzione di strumentazioni molto
  sofisticate

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Isotopo (iso topos) stesso posto La
quantificazione del rapporto da due isotopi dello
stesso elemento ha potenzialità notevoli nello
stabilire se due oggetti chimicamente simili
hanno provenienza diversa, in relazione alla
differenza delle materie prime. Fenomeni di vario
tipo influenzano la distribuzione isotopica degli
elementi nelle materie prime, determinando
differenze nei prodotti finali che possono essere
rivelate dalle tecniche di analisi isotopica Sono
di particolare interesse gli isotopi stabili,
cioè non artificiali. La tecnica che li determina
si chiama Stable Isotope Ratio Analysis (SIRA)
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Applicazioni dellanalisi isotopica

• Misura della temperatura nel passato
• Determinazione dellorigine di acqua, roccie e
  materia organica
• Determinazione dellorigine di droghe, esplosivi
  o altri materiali di interesse forense
• Studi di processo
• Determinazione dellorigine di prodotti alimentari

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Applicazioni in campo alimentare
Lanalisi degli isotopi stabili è molto
importante soprattutto negli studi di autenticità
degli alimenti. Essa, sulla base dei differenti
rapporto isotopici, permette di riconoscere
molecole, presenti in alimenti, aventi la stessa
struttura chimica ma provenienti da materie prime
diverse o elaborate con processi diversi, per
esempio per sintesi biologica o industriale Si
possono distinguere

• gli aromi naturali (es. vanillina) da quelli di
  sintesi
• lacido acetico proveniente dalla fermentazione
  acetica da quello ottenuto industrialmente
• i salmoni selvatici da quelli di allevamento (in
  base ad un lipide caratteristico)
• laggiunta di zuccheri diversi da quelli presenti
  naturalmente
• lannacquamento del latte
• la provenienza geografica di alimenti

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(No Transcript)
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Gli isotopi

• Isotopi di uno stesso elemento hanno uguale
  numero di protoni (e quindi di elettroni) ma
  diverso numero di neutroni
• hanno lo stesso numero atomico (Z) ma un diverso
  numero di massa (A)
• massa differente
• Gli isotopi di uno stesso elemento hanno quindi
  proprietà chimiche simili, in ragione dello
  stesso numero di protoni, ma proprietà fisiche
  diverse, in ragione della massa differente. Tutti
  gli elementi (tranne 12) esistono in almeno due
  forme isotopiche

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Esempio lidrogeno
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Distribuzioni isotopiche
La distribuzione isotopica stabile (non
considerando, cioè, gli isotopi artificiali)
degli elementi dipende strettamente dallorigine
e dallevoluzione biogeochimica dei composti di
cui fanno parte. Quindi due composti aventi la
stessa formula possono avere differente
composizione isotopica se la loro origine e/o la
loro storia sono diverse Le proporzioni degli
isotopi stabili nei vari composti sono
approssimativamente quelle medie esistenti sulla
terra, tuttavia le piccole deviazioni dalla media
sono la chiave per differenziare un campione
dallaltro Nellelenco seguente sono indicate le
distribuzioni medie di alcuni elementi le cifre
indicate in rosso sono quelle che contengono
linformazione discriminante

• 1H 99.984 2H o D 0.01557
• 12C 98.89 13C 1.11140
• 14N 99.64 15N 0.36630
• 16O 99.76 17O 0.04 18O 0.20004
• 32S 95.02 33S 0.75 34S 4.21500 36S0.02

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Per poter mettere in risalto le infinitesime
differenze tra le distribuzioni isotopiche di un
elemento in due campioni diversi è necessaria una
tecnica analitica in grado di misurare masse
atomiche e molecolari con grandissima accuratezza
e precisione. Attualmente due tecniche sono in
grado di soddisfare questi requisiti La
maggior parte delle analisi isotopiche è
effettuata mediante spettrometria di massa

• la spettrometria di massa, utilizzata per
  qualsiasi elemento
• la risonanza magnetica nucleare, utilizzata
  soprattutto per la determinazione degli isotopi
  dellidrogeno (misura del rapporto 2H/1H)

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Rapporti isotopici
Il parametro su cui si basa lanalisi isotopica è
il rapporto isotopico, cioè labbondanza relativa
di due isotopi dello stesso elemento. Per
convenzione, il rapporto isotopico si indica
sempre ponendo a numeratore un isotopo più
pesante e a denominatore un isotopo più leggero
2H/1H
13C/12C
15N/14N
18O/16O 18O/17O 17O/16O
34S/32S 34S/33S 36S/34S ecc. ecc.
I rapporti isotopici più importanti in campo
diagnostico
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Espressione dei risultati
I rapporti isotopici sono usualmente espressi in
termini di valori ?() che esprimono le
deviazioni, in parti per mille, da un materiale
standard di riferimento o lespressione
equivalente dove R rapporto massa isotopo
pesante/massa isotopo leggero (es. 18O/16O)

• ?X gt 0 indica un arricchimento dellisotopo
  pesante nel campione rispetto allo standard
• ?X lt 0 indica un impoverimento dellisotopo
  pesante o un arricchimento dellisotopo leggero
  rispetto allo standard

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Relazione d13C - atomi 13C
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Relazione d15N - atomi 15N
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Standard di riferimento
Elemento Isotopi stabili Abbondanza naturale media () Valori dei rapporti standard Standard di riferimento internazionale
Idrogeno 1H 2H 99.985 0.015 2H/1H 0.000316 SMOW (Standard Mean Ocean Water)
Carbonio 12C 13C 98.892 1.108 13C/12C 0.0112372 PDB (Pee Dee Belemnite) Carbonato di calcio fossile
Azoto 14N 15N 99.6337 0.3663 15N/14N 0.007353 AIR (Azoto dellaria)
Ossigeno 16O 18O 99.7587 0.2039 18O/16O 0.0039948 SMOW (Standard Mean Ocean Water)
Zolfo 32S 34S 95.02 4.22 34S/32S 0.0450045 CDT (Canyon Diablo Troilite)
N.B. la distribuzione isotopica nei materiali
standard di riferimento è differente da quella
naturale media!
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Frazionamento isotopico

• La possibilità di differenziare due campioni in
  base allanalisi isotopica è legata al fenomeno
  di frazionamento isotopico che avviene nelle
  materie prime, ovvero nella deviazione dalla
  distribuzione isotopica naturale degli elementi
  in conseguenza a fenomeni biogeochimici naturali
  o artificiali
• Si noti che le variazioni sono misurate rispetto
  ad un materiale standard con distribuzione
  diversa da quella naturale
• La variazione naturale di abbondanza isotopica è
  conseguenza delle diverse proprietà
  chimico-fisiche degli isotopi di uno stesso
  elemento

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Un esempio il vino
Per valutare le cause e levoluzione del
frazionamento in relazione al ciclo produttivo
degli alimenti, prendiamo in considerazione un
caso particolarmente significativo il vino. In
esso sono presenti in grande quantità gli
elementi di maggior interesse nei processi
biosintetici idrogeno, carbonio e ossigeno.
Questi elementi formano due molecole fondamentali
nella vita delle piante acqua e anidride
carbonica H, C, O ? H2O, CO2
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Frazionamento nellacqua
Lacqua tende per natura ad evaporare con una
reazione di equilibrio regolata dalla
temperatura H218O(g) H216O(l) ? H216O(g)
H218O(l) Allequilibrio, lacqua in fase vapore
si è arricchita in 16O (?18O lt 0) essendo le
molecole di 1H16O più leggere e quindi più
propense allevaporazione. Per lo stesso motivo,
la fase liquida sarà più ricca in 2H16O, 1H18O e
2H18O, molecole più pesanti (?18O e ?2H gt 0) La
costante a di equlibrio tra fase liquida e fase
vapore per l'ossigeno sarà espressa come segue
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Ciclo dellacqua
Durante i fenomeni di evaporazione e
precipitazione si verifica frazionamento
isotopico dellossigeno Lentità del
frazionamento dipende dalla temperatura, la
quantità di umidità rimossa, il tipo di
condensazione (conversione in acqua o in
ghiaccio) e altri fattori climatici e geografici
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Effetto della temperatura

• Essendo il frazionamento dipendente dalla
  temperatura, dal punto di vista geografico il
  valore di ?18O diminuisce
• allaumentare della latitudine
• allaumentare dellaltitudine

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Frazionamento nei vegetali
Nel ciclo vegetativo delle piante, lassorbimento
di acqua dal terreno e il processo di
traspirazione, caratteristico di ciascuna specie,
causano anchessi un arricchimento di isotopi
pesanti (2H e 18O), in dipendenza dalla specie
vegetale e dalle condizioni climatiche (climi
freddi, piovosi o caldo-aridi) Quindi, in
dipendenza di questi parametri, le piante hanno a
disposizione acqua "isotopicamente" diversa, da
utilizzare nella fotosintesi
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Esempi di frazionamento 18O/16O
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Ciclo della CO2
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Frazionamento biosintetico
Il ciclo della fotosintesi con la produzione di
glucosio determina ancora una modifica isotopica
per quanto riguarda il contenuto in deuterio
dell'acqua, ma diventa estremamente selettivo per
quanto riguarda l'anidride carbonica e quindi il
rapporto isotopico 13C/12C. Il cammino
fotosintetico per la fissazione della CO2 ne è
infatti la principale fonte di variazione. Le
piante incorporano CO2 secondo tre meccanismi
biosintetici Il meccanismo C3 provoca un
frazionamento del carbonio molto più elevato
rispetto agli altri due meccanismi. Gli isotopi
più pesanti, in questo caso il 13C, sono
cineticamente meno favoriti e quindi più lenti a
reagire, per cui, maggiore è il numero dei
passaggi di reazione e tanto più sarà selettivo
il processo

• il ciclo di Calvin o C3 (es. vite e barbabietola)
• il ciclo di Hatch-Slack o C4 (es. canna e mais)
• il ciclo noto come Crassulean Acid Methabolism o
  CAM, meno comune

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Frazionamento di 12C e 13C
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Al termine del ciclo sintetico si producono
molecole di glucosio che hanno un contenuto
isotopico correlato a quello dell'acqua e
dell'anidride carbonica impiegate, nonché del
ciclo fotosintetico seguito La successiva
fermentazione alcolica che trasforma il glucosio
ad alcol etilico modifica solo in parte i
rapporti isotopici (maggiormente per D/H), per
cui essi si ritrovano nelle molecole di alcol
etilico prodotte
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Parametri D/H nei vegetali
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Esempi di frazionamento 2D/1H
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Ciclo dellazoto nei composti vegetali
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Spettrometria di massa
La spettrometria di massa è una tecnica
utilizzata per separare molecole cariche, cioè
ioni, in base alla loro massa o, più
correttamente, in base al rapporto massa/carica.
Quindi è una tecnica in grado di distinguere
isotopi dello stesso elemento e di calcolarne i
rapporti isotopici I rapporti isotopici degli
elementi leggeri (H, O, C, N, S) sono misurati
con la tecnica Isotope Ratio Mass Spectrometry
(IRMS) mediante trasformazione in gas puri Per
gli elementi pesanti (Pb, Sr) sono invece
utilizzate la tecnica Inductively Coupled Plasma
Mass Spectrometry (ICP-MS) e la tecnica Thermal
Ionization Mass Spectrometry (TIMS) nelle quali
il campione è trasformato in atomi e ioni
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Isotope Ratio Mass Spectrometry
Nella tecnica Isotope Ratio Mass Spectrometer
(IRMS) si utilizza uno spettrometro di massa
avente sensibilità minore ma capacità di
risoluzione e precisione assai più elevata
rispetto agli spettrometri convenzionali Lo
spettrometro IRMS comprende tre parti
fondamentali una sorgente di ioni, un
analizzatore di massa e un contatore di ioni

• La sorgente di ioni ha lo scopo di ionizzare le
  molecole del campione (generalmente introdotto in
  forma gassosa) per interazione con un fascio di
  elettroni che causa la formazione di ioni
  positivi dai composti del campione
• Gli ioni positivi sono poi accelerati e condotti
  allinterno dellanalizzatore di massa, ovvero un
  campo elettromagnetico dove gli ioni sono
  separati a seconda del loro rapporto massa/carica
  (m/z)
• Infine gli ioni sono raccolti e contati da un
  rivelatore

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Principio di funzionamento
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Preparazione del campione
Per effettuare la misura con la IRMS è necessario
convertire lelemento di interesse nel campione
in forma gassosa Esempio determinazione
del rapporto 13C/12C nel vino (alcol etilico)
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Cosa si misura effettivamente?

• Idrogeno ? H2 masse 2, 3
• 2 1H1H
• 3 1H2D
• Carbonio ? ossidazione con O2 ? CO2 masse 44,
  45, 46
• 44 12C16O16O
• 45 13C16O16O e 12C16O17O
• 46 13C16O17O e 12C17O17O
• Azoto ? N2 masse 28, 29, 30
• 28 14N14N
• 29 14N15N
• 30 15N15N
• Zolfo ? ossidazione con O2 ? SO2 masse 64, 66
• 64 32S16O16O
• 66 34S16O16O

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Specie misurate
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Dual Inlet
Il dispositivo Dual Inlet permette di avere un
confronto in tempo reale tra il campione
analizzato e un materiale di riferimento Il gas
formato dal trattamento del campione è immesso
nellIRMS in alternanza ad un gas standard avente
distribuzione isotopica ben definita dal
confronto è possibile misurare con accuratezza i
rapporti isotopici nel campione
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(No Transcript)
38
Tecnica Continuous Flow
Nel metodo Continuous Flow la preparazione del
campione e la successiva analisi avvengono in un
flusso continuo di gas elio. I passaggi sono
automatizzati e prevedono combustione, riduzione
e pirolisi in presenza di catalizzatori
Dual Inlet
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Interfacciamento con GC
Lutilizzo di un gascromatografo permette di
avere la separazione dei composti contenenti
lelemento di interesse preliminare allanalisi
di massa
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La separazione gascromatografica fornisce
lidentificazione delle sostanze (What?), mentre
lanalisi IRMS fornisce informazioni sulla loro
origine (Where? Where from?)
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Esempi di strumenti
Nelle figure sono riportati due esempi di
spettrometri di massa per analisi IRMS. Si tratta
generalmente di strumenti di costo elevato,
accessibile soltanto a laboratori di analisi
molto avanzati
Molti spettrometri per analisi IRMS sono dotati
anche di un gascromatografo per la separazione di
specie organiche preliminare allanalisi degli
isotopi
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Lanalisi isotopica in enologia
La ricerca di sofisticazioni in enologia si può
effettuare con le tecniche isotopiche Inoltre
si può stabilire con discreta approssimazione la
zona di provenienza di un vino Per chiarire
limportanza dellintroduzione di queste tecniche
va considerato che prima del loro avvento, i
metodi esistenti per scoprire le sofisticazioni
erano abbastanza inefficaci. Laddizione di
saccarosio ai mosti genera rapidamente per
idrolisi fruttosio e glucosio, zuccheri già
presenti nelluva e quindi indistinguibili
Le molecole di fruttosio e glucosio introdotte
fraudolentemente hanno però una traccia della
loro origine, nascosta nella distribuzione
isotopica degli elementi che li costituiscono
(carbonio, idrogeno e ossigeno). Questa
distribuzione è diversa a seconda dellorigine
del saccarosio o del trattamento cui è stato
sottoposto

• sofisticazione del vino per aggiunta di zuccheri
  diversi da quelli presenti nelluva (bietola,
  canna, mais), una pratica illecita in Italia
• annacquamento del vino

?

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Informazioni fornite dai r.i.
In definitiva, i fenomeni naturali che si
succedono durante il ciclo degli elementi C, H e
O sono tali da permettere una differenziazione
del prodotto finale. In base al tipo di rapporto
isotopico in considerazione, si possono avere le
informazioni descritte nella tabella
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Antisofisticazioni
La contraffazione dovuta alladdizione di
zuccheri di canna o bietola è relativamente
semplice da identificare, in base al rapporto
isotopico D/H. Il valore dovuto allo zucchero
presente naturalmente nel vino è 98-102 ppm
valori superiori indicano addizione di zucchero
di canna e mais, mentre valori inferiori indicano
addizione di zucchero di bietola. La misura è
effettuata normalmente con la tecnica di
Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) L'aggiunta di
una miscela equivalente di zuccheri di canna e
bietola non modifica il rapporto isotopico del
deuterio, ma è comunque evidenziabile
dall'aumentare del rapporto isotopico
13C/12C Lannacquamento del vino è rivelabile in
base al rapporto 18O/16O infatti lacqua esterna
ha un contenuto in 18O minore dell'acqua del vino
e farà diminuire di conseguenza il valore del
rapporto isotopico misurato. La misura è
effettuata normalmente con una tecnica di
Spettrometria di Massa
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Metodi ufficiali di analisi
Le potenzialità dellanalisi isotopica sono tali
che nel corso degli ultimi anni alcuni metodi di
analisi sono diventati ufficiali al livello
nazionale ed europeo

• Il Regolamento CEE 2676/90 (determinazione dei
  metodi comunitari di analisi da utilizzare nel
  settore del vino) prevede la rivelazione
  dellaumento del titolo alcolimetrico di mosti e
  vini, ottenuto con addizione fraudolenta di
  saccarosio, mediante analisi NMR del rapporto D/H
• Il Regolamento CEE 822/97 (modifica del
  Regolamento precedente) prevede la determinazione
  del rapporto isotopico 18O/16O dellacqua
  contenuta nei vini per identificare il possibile
  fraudolento annacquamento di un vino
• Il Decreto Ministeriale 16-02-93 prevede la
  determinazione del rapporto isotopico 13C/12C
  dellalcol in mosti e vini mediante tecnica IRMS
  per identificare laddizione fraudolenta di
  miscele di saccarosio da bietola e canna

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Qualche esempio
Analisi isotopica 13C/12C e D/H su vini sloveni.
Dal confronto con vini non adulterati è possibile
definire tre aree una per le adulterazioni con
zucchero di canna, una per le adulterazioni con
zucchero di bietola e una per le adulterazioni
con miscele
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Analisi di whisky
La determinazione del rapporto D/H può fornire
indicazioni sullautenticità di liquori pregiati
come il whisky, permettendo di differenziare il
whisky da grano o bourbon (il grano è una pianta
con cammino biosintetico del tipo C4), il whisky
single malt da orzo (pianta C3) e il whisky
blended, in cui letanolo deriva da una miscela
grano-orzo
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Lestrema facilità della distribuzione isotopica
degli elementi leggeri (H, C, O, N ed S) a
variare in conseguenza di fenomeni vari, è
causata dal fatto che il parametro ?m/m, legato
alla differenza di massa, per gli isotopi di
questi elementi è elevato e quindi gli effetti di
frazionamento di massa influenzano pesantemente i
valori finali negli alimenti che li contengono.
Tutte le reazioni che dipendono dalla massa
provocheranno infatti un frazionamento Esempi di
?m/m idrogeno D/H ? (2-1)/2 ?
0.5 carbonio 13C/12C ? (13-12)/13 ?
0.0769 13CO2/12CO2 ? (45-44)/45 ?
0.0222 ossigeno 18O/16O ? (18-16)/18 ?
0.111 H218O/H216O ? (20-18)/20 ? 0.1
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Necessità di database
La facilità di frazionamento, dovuta alla
significativa differenza di massa tra isotopi, è
insieme il punto forte e il limite dellanalisi
isotopica applicata agli elementi leggeri. Dal
punto di vista del controllo antiadulterazione
ciò facilita enormemente il metodo di
riconoscimento, ma dal punto di vista della
provenienza geografica è evidente che esiste una
variabilità naturale dei dati che rende difficile
avere riferimenti ben precisi Per questi motivi
lanalisi isotopica degli elementi leggeri è
ancora allo stadio sperimentale per quanto
riguarda la determinazione della provenienza.
Sono necessarie raccolte di dati molto ampie, che
tengano conto di tutte le variazioni possibili
(stagionali, climatiche). Inoltre, è necessario
tener conto delle possibili variazioni
artificiali introdotte nel ciclo produttivo
(addizione di composti con distribuzione
isotopica differente) Sicuramente lapproccio
migliore consiste nel tenere conto di dati
isotopici e dati di concentrazione relativi ad
elementi in tracce
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Banche Dati
Va considerato che la variazione dei rapporti
isotopici dell'alcol di vino può essere
oscillante. Ad esempio per il rapporto D/H nei
vini italiani, a seconda della latitudine, del
clima e della piovosità si possono avere valori
compresi tra circa 98 e 107 ppm Per avere un
campione statistico rappresentativo di tutta la
produzione viticola italiana è necessario
effettuare un'indagine su tutto il territorio
nazionale. A questo scopo sono state costituite,
a partire dal 1987, col patrocinio del Ministero
delle Politiche Agricole e Forestali -
Ispettorato Centrale per la Repressione delle
Frodi, le Banche Dati su campioni di vino
sicuramente genuini e provenienti da tutta
Italia. Ogni anno vengono raccolti circa 500
campioni di uva da tutte le regioni italiane e
per ogni prelievo viene compilata una scheda con
le principali informazioni del vigneto dati
relativi alla produzione (kg per ceppo, resa per
ettaro) eventuale irrigazione, piovosità. Tali
uve vengono successivamente vinificate in
laboratorio, ottenendo il vino da analizzare Nel
caso del Rapporto isotopico del deuterio, la
Banca Dati Italiana è stata formalmente validata
da una Commissione della Comunità Europea, che si
avvale del contributo tecnico del Joint Research
Centre di Ispra A livello europeo, dal 1990
esiste un database di vini che raccoglie dati da
campioni di provenienza certa vinificati in
Europa, secondo le indicazioni del Regolamento UE
2676/90. Oltre ai dati dei valori D/H
originariamente previsti, attualmente il database
comprende anche valori di ?13C deletanolo e di
?18O dellacqua di vino. Siccome le possibilità
di adulterazione comprendono lutilizzo di mosti
rettificati, zuccheri e prodotti vari da paesi
del terzo mondo, si stanno raccogliendo dati
anche da vini provenienti da questi paesi
51
Determinazione della provenienza
Oltre allutilizzo nellidentificazione di
sofisticazioni, lanalisi isotopica è impiegata
nella caratterizzazione dal punto geografico dei
prodotti enologici. Come si è detto in
precedenza, infatti, uve cresciute in zone
climaticamente diverse daranno vini in cui C, H e
O (presenti in etanolo e acqua) avranno subito
frazionamenti isotopici conseguentemente diversi
Nella figura a fianco sono riportati i valori di
?18O per vini provenienti da Le differenze
risultano essere significative

• Paesi europei caldi (Spagna, Portogallo)
• Paesi europei temperati (Francia, Italia)
• Paesi europei freddi e umidi (Germania, Austria)

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Problemi nella determinazione della provenienza
Per la determinazione della provenienza
regionale, si possono utilizzare gli stessi
parametri utili a identificare le adulterazioni,
cioè ?13C e ?18O di etanolo e acqua di vino. La
base è ovviamente il database UE. La
determinazione è però resa problematica dal fatto
che i campioni incogniti possono essere stati
soggetti ad adulterazione, rendendo difficile la
collocazione allinterno del database. Inoltre le
variazioni stagionali naturali possono essere
significative (figura sotto - ?18O di vini
tedeschi della Franconia in annate diverse
Una misura alternativa può essere la
determinazione del rapporto isotopico dellazoto
(15N/14N) dagli aminoacidi, che però può essere
influenzato dalladdizione di sali di ammonio per
la fermentazione Lapproccio migliore sembra
quindi essere un impiego di più variabili, sia
isotopiche sia di altro genere
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Analisi di vini tedeschi
Nella figura sono mostrati i valori di ?13C e
?18O rilevati in vini di presunta produzione
tedesca e ritenuti di pregio. In realtà, dal
confronto con i dati del database UE sembra
evidente che alcuni campioni sono miscele di vini
tedeschi e vini provenienti dallEuropa
meridionale
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Analisi isotopica e PCA
Analisi isotopica 13C/12C, 18O/16O e D/H su vini
sloveni. In questo caso lobiettivo è verificare
la possibilità di differenziare vini provenienti
da regioni vinicole diverse Utilizzando i
parametri isotopici e trattando statisticamente i
dati secondo il metodo chemiometrico PCA, si
verifica una buona separazione tra i tre gruppi
considerati
55
Tracciabilità con l'analisi isotopica?
Come si è visto, l'analisi isotopica degli
elementi leggeri trova moltissime applicazioni
nell'autenticazione dei prodotti alimentari.
Seppure con notevoli difficoltà, è possibile
applicarla anche alla provenienza geografica Ma
per quanto riguarda la tracciabilità? Per trovare
il collegamento tra il prodotto finito e le
materie prime, sarebbe necessario investigare
lungo la filiera fino ad individuare il legame
con il terreno. La determinazione dei rapporti
isotopici di C, H, N, O e S nel terreno è
difficile da effettuare, a causa della mancanza
di uniformità della matrice. Nel terreno sono
presenti in concentrazioni elevate moltissimi
composti contenenti gli elementi leggeri, a
differenza per esempio del vino in cui letanolo
e lacqua sono assolutamente prevalenti come
composti su cui determinare i rapporti isotopici
di C e O Lanalisi isotopica sul terreno non ha
quindi applicazioni pratiche e di fatto lunico
collegamento con il territorio consiste nella
possibilità di analizzare campioni di provenienza
certa
56
Analisi isotopica di elementi pesanti
Un'alternativa all'analisi isotopica degli
elementi leggeri è quella degli elementi pesanti,
generalmente presenti negli alimenti in
concentrazioni a livello di tracce (lt 0.1) Gli
elementi in tracce negli alimenti hanno
concentrazioni bassissime e dipendenti da fattori
vari, tra cui lorigine geografica. Durante
lassunzione delle sostanze minerali da parte
delle piante non si ha frazionamento isotopico
significativo per gli elementi presenti in tracce
nel terreno. Quindi, i loro rapporti isotopici
sono eccellenti indicatori di provenienza o
traccianti Per questo motivo, il collegamento
degli alimenti con il terreno è studiato mediante
lanalisi isotopica di elementi più pesanti,
quali lo stronzio (Sr) e il piombo (Pb), che sono
presenti nel terreno in quantità limitate. Questi
elementi hanno una distribuzione isotopica
differente da terreno a terreno, che può agire da
impronta digitale Le principali applicazioni
dellanalisi isotopica degli elementi pesanti si
hanno in campo enologico
57
Cause di frazionamento negli elementi pesanti
La causa principale del frazionamento isotopico
negli elementi pesanti è la formazione di nuclidi
figli radiogenici a partire da nuclidi madri
radioattivi per via di trasmutazioni nucleari che
avvengono in continuo (su scala geologica). La
quantità di nuclidi madri varia da minerale a
minerale e quindi rocce di origine diversa
contengono nuclidi figli in quantità
conseguentemente differente da sito a
sito Inoltre, la maggior parte degli elementi
pesanti (eccezion fatta per il ferro) non sono
essenziali per la vita o hanno un ruolo minore
rispetto ai bioelementi più leggeri (H, C, N, O,
S, P, Ca) e ciò limita la possibilità di
frazionamento isotopico causato da processi
biologici
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Alcuni esempi di nuclidi utili
Nella tabella sono riportati alcuni tra i più
importanti nuclidi radioattivi (madri) e
radiogenici (figli) considerati come traccianti
petrogenetici e, in quanto tali, utili per la
determinazione delletà in geocronometria è
indicato inoltre il rapporto isotopico per il
quale essi sono traccianti anche in studi sulle
piante
59
Contenuto di Sr nei vini
La concentrazione di Sr nel vino varia tra 60 ppb
e 7 ppm a seconda della sua origine. Si può
quindi definire un microelemento o elemento in
tracce nel vino. Nellambito della filiera del
vino, la concentrazione di Sr tende a
incrementare dalluva al mosto fino al vino,
probabilmente a causa del rilascio di ioni Sr2
contenuti nei semi e nelle bucce. Inoltre ci può
essere un apporto artificiale di ione Sr2 dovuto
alluso di fertilizzanti o a pratiche di cantina
come la chiarificazione con bentonite e la
deacidificazione con CaCO3 o altri composti di Ca
che possono contenere impurezze (lo ione Sr2 è
ione vicariante dello ione Ca2)
La concentrazione di Sr è quindi poco utile per
tracciare la filiera
60
Distribuzione isotopica di Sr
Gli isotopi naturali dello stronzio sono
4 Lisotopo 87Sr è lunico radiogenico, cioè
proveniente dal decadimento radioattivo di un
altro nuclide è il prodotto di decadimento ?-
dellisotopo 87Rb (tempo di mezza vita
4.881010 anni) 87Rb ? 87Sr ?-

• 84Sr (0.56)
• 86Sr (9.86)
• 87Sr (7.00)
• 88Sr (82.6)

61
Il nuclide 87Sr come tracciante
La concentrazione del nuclide 87Sr aumenta
gradualmente col tempo nei minerali, a differenza
degli altri isotopi di Sr. Quindi, il rapporto
87Sr/86Sr tende ad aumentare in maniera
relativamente a tempi geologici. Questa è la base
per un metodo di datazione comunemente utilizzato
in geochimica il sistema Rb/Sr è un vero e
proprio orologio radioattivo per la datazione dei
minerali ed è usato per datare antiche rocce
terrestri ignee e metamorfiche e campioni di
rocce lunari. Ad esempio, nelle rocce granitiche,
più antiche geologicamente, il valore del
rapporto 87Sr/86Sr è tipicamente 0.710, mentre in
rocce basaltiche, più giovani, il rapporto varia
tra 0.702 e 0.705 Dal punto di vista della
tracciabilità, quel che più conta è che il
rapporto 87Sr/86Sr varia a seconda delletà
geologica del terreno e quindi a seconda
dellarea geografica. Terreni molto antichi
avranno valori più alti di questo rapporto,
mentre terreni geologicamente giovani avranno
valori più bassi. In definitiva il nuclide 87Sr
agisce da tracciante
62
Il rapporto 87Sr/86Sr nella filiera
Limpiego degli isotopi dello stronzio come
marcatori nel vino è stato introdotto da
ricercatori tedeschi nel 1992. Il rapporto
87Sr/86Sr può essere utilizzato come tracciante
dellorigine del vino se esiste una correlazione
significativa tra il valore di questo rapporto
nel terreno e nel vino e se esistono differenze
significative tra vini di differente provenienza
geografica Naturalmente, occorre verificare se la
distribuzione isotopica di Sr rimane inalterata
nel trasferimento di sostanze nutrienti dal
terreno alle piante e nei vari passaggi della
filiera del vino. Se così fosse, la distribuzione
isotopica nel vino dovrebbe riflettere quella del
terreno da cui si originano le viti
63
Frazionamento di Sr
Il valore di ?m/m per il rapporto isotopico
87Sr/86Sr è molto basso 87Sr/86Sr ? (87-86)/87
? 0.0115 In base a questo valore, si può stimare
che Sr tenda a frazionarsi poco. Per questo
motivo, a differenza dei rapporti isotopici degli
elementi leggeri, è lecito attendersi scarsi
effetti di frazionamento di massa sulla
distribuzione di Sr, dovuti a processi naturali o
artificiali
64
Verifica...
La bontà delle ipotesi enunciate in precedenza è
verificata in uno studio effettuato da
ricercatori Portoghesi, i quali hanno determinato
il rapporto 87Sr/86Sr in due vini rossi
provenienti dalla regione del Douro (Portogallo
nordorientale), effettuando anche misure in vari
punti della filiera. I vini sono stati ottenuto
da vigne cresciute in un vigneto più antico (70
anni) e in un vigneto più giovane (10 anni),
entrambi su terreno composto da materiale
scistoso. La vinificazione è stata effettuata
secondo un protocollo ben definito, anche se
differente da un vino allaltro

• le uve del vigneto più vecchio sono state
  vinificate a mano secondo una procedura antica
  che prevede un numero limitato di passaggi le
  uve sono polivarietali, cioè di varietà diverse
  di Vitis vinifera, e danno un vino rosso simile
  al Porto, di cui è previsto linvecchiamento da 2
  a 20 anni (per motivi di praticità il vino è
  stato analizzato dopo un solo anno di
  invecchiamento)
• le uve del vigneto più giovane sono invece
  monovarietali del tipo Touriga Nacional e sono
  state vinificate con procedimento più complesso,
  costituito da un numero superiore di passaggi

65
Schema della vinificazione
Schema della vinificazione (a) Vigneto antico (b)
Vigneto giovane
66
Misurazione del rapporto 87Sr/86Sr
Il rapporto 87Sr/86Sr è stato misurato in tutti i
campioni prelevati e riconducibili alle seguenti
matrici La misura del rapporto isotopico è
stata effettuata con la tecnica di spettrometria
di massa con plasma induttivamente accoppiato
(ICP-MS). In questa tecnica è utilizzato sempre
lo spettrometro di massa per separare ioni in
base al rapporto massa/carica differisce dalla
tecnica descritta in precedenza per il fatto che
è utilizzato un plasma per avere il campione in
forma di ioni monoatomici La misura è realizzata
misurando i segnali a rapporto massa/carica 86
(dovuto allisotopo 86Sr) e 87 (dovuto
allisotopo 87Sr), e ottenendo matematicamente il
valore del r.i. Per avere un riferimento preciso
dei valori di distribuzione isotopica, è stato
analizzato anche un campione standard avente
distribuzione certificata, composto da SrCO3

• Terreno del vigneto
• Mosto
• Vino stabilizzato e invecchiato

67
Risultati
Come si nota dalla tabella, i valori di 87Sr/86Sr
sono molto simili tra mosto e vino, e tra i due
vini ottenuti con metodi di vinificazione molto
diversi. Risulta evidente, quindi, che nè la
fermentazione nè il processo globale di
vinificazione influenzano la distribuzione
isotopica di Sr Effettuando un test
statistico (paired t-test) sui valori di r.i. in
terreno, mosto e vino, i tre valori non risultano
essere significativamente diversi ciò rende il
parametro adatto come marcatore dellorigine dei
vini in esame. Inoltre, il valore ottenuto è
identico a quelli misurati da altri ricercatori
in vini provenienti dalla stessa regione e
differente da quelli misurati in vini di altri
distretti portoghesi come Bairrada e Borba
(Portogallo centrale e sudorientale)
68
Concentrazione totale di Sr
Per confronto, si valuti la variazione della
concentrazione totale di Sr nei mosti e nei vari
passaggi di vinificazione (a) Vigneto antico (b)
Vigneto giovane Il passaggio dal mosto al
vino causa un incremento di circa 3 volte della
concentrazione di Sr è evidente che questo
parametro non può essere utilizzato come
tracciante, a differenza del rapporto isotopico
69
Complicazioni nella misura
La misura del rapporto 87Sr/86Sr, effettuata con
tecnica ICP-MS, è complicata dal fatto che il
nuclide 87Sr è isobaro con 87Rb, un isotopo
maggiore del metallo alcalino rubidio. Dal punto
di vista chimico le due specie hanno
comportamento diverso, ma dal punto di vista
fisico risultano avere la stessa massa Nelle
condizioni di misura allinterno dello
spettrometro di massa, i due nuclidi, avendo
rapporto massa/carica molto simile, danno segnali
indistinguibili al valore di massa/carica 87,
il segnale è dovuto alla somma dei contributi di
87Sr e 87Rb La possibilità di discriminare i due
segnali è legata alla capacità di risoluzione
dellanalizzatore di massa. I valori esatti del
rapporto massa/carica sono 86.908882 per 87Sr e
86.909186 per 87Rb la vicinanza è tale che per
discriminare i due contributi sarebbe necessaria
una risoluzione (m/?m) di circa 3105,
impossibile da ottenere per i normali strumenti
commerciali
70
Contenuto di Rb nel vino
Il rubidio crea quindi interferenza positiva, in
quanto il segnale del suo isotopo 87Rb si somma a
quello della specie che si desidera determinare,
cioè 87Sr. Il rubidio è solitamente presente
nelluva e nel vino in quantità maggiori rispetto
a Sr (0.2 - 4.2 mg/l nel vino) inoltre, mentre
lisotopo 87Sr corrisponde al 7.00 del totale di
stronzio, lisotopo 87Rb corrisponde al 27.8 del
totale di rubidio. Si tratta quindi di una
presenza ingombrante Per questi motivi, per avere
una misura accurata dellabbondanza di 87Sr e
quindi un valore di r.i. affidabile, è necessario
rimuovere lo ione Rb dai campioni
preliminarmente alla misura isotopica
71
Rimozione di Rb
La rimozione di Rb dai campioni è basata sulla
diversa affinità che gli ioni Rb ed Sr2 hanno
nei confronti del trattenimento per attrazione
elettrostatica su una resina a scambio cationico.
Il meccanismo del trattenimento è la seguente
reazione di equilibrio n(R-SO3-H) Men ?
n(R-SO3-)Men nH Il controione H è
facilmente scambiabile e può essere sostituito
con cationi a densità di carica maggiore. Il
campione liquido (pH corretto a 4) è immesso
nella colonna contenente la resina. Lo ione Sr2
ha maggiore affinità dello ione Rb per i siti di
scambio cationico, ovvero la reazione 2(R-SO3-H)
Sr2 ? 2(R-SO3-)Sr2 2H è preferenziale
rispetto alla reazione R-SO3-H Rb ?
R-SO3-Rb H
72
Recupero di Sr
Il passaggio su colonna ha quindi leffetto di
favorire il trattenimento dello ione Sr2, mentre
lo ione Rb, non essendo trattenuto va allo
scarico ed è quindi eliminato. Successivamente,
si ottiene il desorbimento degli ioni Sr2
facendo passare una soluzione molto concentrata
di H (generalmente HCl concentrato) che
rimpiazza gli ioni dai siti di scambio cationico
per via della legge dellazione di
massa 2(R-SO3-Sr2) 2H ? n(R-SO3-)Men
nH Leluato acido contiene tutti gli ioni Sr2
precedentemente trattenuti utilizzando un volume
di eluente uguale al volume di campione immesso
in colonna si ripristina la concentrazione
iniziale, anche se in realtà ciò non è importante
per lesito della misura isotopica, in quanto i
processi descritti nella separazione
cromatografica non alterano la distribuzione
isotopica
73
Ulteriori trattamenti
Preliminarmente alla separazione cromatografica
Sr/Rb, si usa effettuare un pretrattamento sul
campione (mosto o vino) che consiste nel
distruggere la matrice organica. Ciò ha lo scopo
di evitare lintroduzione nel sistema di misura
di specie potenzialmente interferenti dal punto
di vista della misura con spettrometria di massa
inoltre, favorisce lefficienza della separazione
cromatografica Sr/Rb Il pretrattamento consiste
in unirradiazione con raggi UV del campione
miscelato ad acqua ossigenata al 30, che
coadiuva la degradazione fotolitica dei composti
organici presenti. Il trattamento è portato
avanti per un tempo definito e causa la
distruzione delle principali sostanze presenti
nel mosto e nel vino, in particolare polifenoli,
zuccheri e proteine (C, H, O) H2O2 h? ? H2O
CO2
74
Confronto tra vini di regioni diverse
Nella figura sono riportati i valori di 87Sr/86Sr
per vini da tavola (T) e vini fortificati (R)
provenienti da alcune regione vinicole I
l risultati indicano che vini provenienti da
regioni diverse hanno valori di 87Sr/86Sr
statisticamente differenti, e quindi il parametro
isotopico può costituire una promettente impronta
digitale dellorigine del vino

• portoghesi
• Douro (R1)
• Dão (R2)
• Bairrada (R3)
• Borba (R4)
• Madeira (R5)
• francesi
• Bordeaux (R6)

75
Nella tabella sono riportati i valori di
87Sr/86Sr per vini di regioni diverse
Si noti come vini provenienti da suoli basaltici
(più giovani geologicamente) abbiano valori
minori di vini provenienti da suoli granitici
(più antichi)
76
Altri risultati di determinazione di 87Sr/86Sr in
vini di regioni diverse
77
Il piombo
Un altro elemento pesante di grande potenzialità
dal punto di vista della tracciabilità è il
piombo (Pb). Questo elemento è un tracciante
effettivo dellattività antropogenica, essendo un
testimone dellimpatto che luomo ha sui cicli
ambientali Dallinizio dellindustrializzazione e
in particolare dallintroduzione del piombo
tetraetile nelle benzine come antidetonante
(1939), si è registrato un incremento di
inquinamento da piombo nellambiente, in quanto
esso, pur essendo liberato a terra dagli scarichi
delle macchine, è veicolato in tutti i settori
dellatmosfera e si ritrova anche a latitudini
insospettabili. È stata dimostrata la stretta
correlazione tra emissioni di Pb dagli scarichi e
contenuto di Pb nei terreni, nelle piante e
indirettamente in uva e vino Questa tendenza si è
invertita negli anni 70, grazie alla riduzione
del contenuto di Pb nelle benzine, ed è in forte
calo attualmente con leliminazione quasi totale
e lintroduzione della benzina verde
78
Il piombo nel vino
A causa della correlazione tra inquinamento da Pb
e contenuto di Pb nelle piante, il vino risulta
essere un marcatore dellambiente e, seppur a
malincuore, esso costituisce un interessante
archivio dei cambiamenti ambientali. Analizzando
il contenuto di Pb in vini prodotti dallo stesso
vigneto, è possibile individuare una tendenza
parallela alla quantità di emissioni di Pb in
atmosfera Il contenuto medio di Pb nei vini è
attorno a 60 µg/l, con variazioni nel range
10-300. Un contenuto inferiore a 100 µg/l è
considerato non contaminato. Va considerato che
Pb è un elemento tossico e non essenziale per
lorganismo, quindi il suo contenuto nel vino
deve essere necessariamente ridotto al di sotto
di 250 µg/l secondo le indicazioni dellOffice
International de la Vigne et du Vin
79
Esempio di serie temporale
Nella figura è riportato landamento del
contenuto di Pb in campioni di vino provenienti
dallo stesso vigneto, localizzato nella Francia
sudorientale. La verticale di vino comprende le
annate dal 1950 al 1991. La concentrazione totale
(?) fluttua tra 78 e 227 µg/l fino al 1980,
dopodichè si attesta ben al di sotto di 100 µg/l
con fluttuazioni minori
La concentrazione più bassa, 40 µg/l, si ha nel
campione dellannata 1990 e la tendenza indica
chiaramente un decremento della concentrazione.
La tendenza al decremento inizia già nel 1974, ma
è interrotta da alti valori nelle annate 1978 e
1980 Questi risultati sembrano indicare che il
contenuto di Pb nel vino
riflette limpiego di antidetonante a base di
composti di organoPb, che è in diminuzione in
Europa da alcuni decenni
80
Composti di organopiombo
Pb è presente nel vino sia sotto forma di ione
Pb2, sia sotto forma di composto
organometallico, in particolare trimetilpiombo,
(CH3)3Pb, e trietilpiombo, (CH3CH2)3Pb. Questi
composti derivano da (CH3)4Pb e (CH3CH2)4Pb, i
famigerati composti antidetonanti addizionati
dalle benzine. Attraverso una parziale
decomposizione in atmosfera, i composti di
organopiombo ricadono sul suolo e sono assorbiti
dalla vite. I livelli di questi composti nel vino
sono 10-500 ng/l per (CH3)3Pb e 0-50 ng/l per
(CH3CH2)3Pb in vini provenienti da zone vicine a
traffico veicolare intenso. Con lintroduzione
delle benzine unleaded, il livello di questi
composti è diminuito nettamente in tutto il mondo
81
OrganoPb come marcatori
Il contenuto di questi composti nel vino è un
indice grossolano della sua origine e dellanno
di produzione, in quanto segue landamento
dellimpiego di antidetonanti a base di Pb nelle
benzine

• Vini esenti da organoPb sono originari da paesi
  che hanno bandito da tempo luso di composti di
  Pb nelle benzine, come USA e Australia, oppure
  sono vini europei molto recenti
• Un contenuto non nullo è correlabile con letà in
  base al rapporto relativo tra trimetil- e
  trietilPb in particolare, prima del 1960 il
  trimetilPb è sempre assente
• Livelli elevati di organoPb indicano prossimità a
  zone ad

alto traffico veicolare lopposto indica vini da
zone rurali
82
Distribuzione isotopica di Pb
Il piombo esiste in natura in quattro forme
isotopiche stabili Gli isotopi 206Pb, 207Pb
e 208Pb sono radiogenici, in quanto derivano dal
decadimento radioattivo, rispettivamente, dei
nuclidi 238U, 235U e 232Th. Lisotopo 204Pb è
invece non radiogenico. Labbondanza degli
isotopi radiogenici tende quindi ad aumentare nel
tempo Analogamente a Sr, le percentuali relative
degli isotopi variano in funzione della genesi
delle rocce, che contengono U e Th in quantità
differenti. Quindi, a seconda delletà geologica
delle rocce e della loro collocazione geografica,
le rocce e i terreni contenenti Pb hanno
distribuzioni isotopiche differenti, in maniera
ancora più vantaggio rispetto a Sr in quanto per
Pb sono possibili frazionamenti diversi

• 204Pb (1.4)
• 206Pb (24.1)
• 207Pb (22.1)
• 208Pb (52.4)

83
Analisi isotopica di Pb
Un buon motivo per utilizzare la distribuzione
isotopica di Pb come tracciante consiste nel
fatto che le variazioni dalla distribuzione media
sono molto più ampie rispetto a quelle degli
elementi leggeri. Si consideri che la differenza
di distribuzione isotopica tra le due miniere di
Pb più importanti al mondo (nel Missouri, USA, e
a Broken Hill in Australia) è circa 30, un
valore enorme Il piombo tetraetile addizionato
alle benzine porta in sè unimpronta digitale
isotopica che si trasmette ai composti di
organoPb emessi in atmosfera, i quali si
diffondono in tutto il pianeta ma per la maggior
parte tendono a decomporsi e a rimanere nel
comparto geografico locale. La ricaduta sul
terreno trasmette limpronta isotopica alle
piante e infine al vino. Questo è il motivo per
cui vini provenienti dagli USA e dallAustralia
sono facilmente distinguibili in base ai r.i.
206Pb/207Pb e 208Pb/207Pb, che riflettono la
distribuzione isotopica del minerale piombifero
estratto nelle miniere locali (rispettivamente
Missouri e Broken Hill) e utilizzato per produrre
lantidetonante. In Europa la situazione è
intermedia in quanto Pb arriva da sorgenti
diverse (Marocco, Australia, ecc.)
84
Misurazione dei rapporti di Pb
Il valore di ?m/m per i rapporti isotopici di Pb
sono bassissimi 208Pb/206Sr ? (208-206)/208 ?
0.0096 Il frazionamento isotopico di Pb per
fenomeni biologici o artificiali è irrilevante
rispetto alle differenze esistenti nelle rocce,
che discendono dal contenuto di nuclidi madri (Th
e U). Quindi i r.i. di Pb riflettono
esclusivamente le differenze geochimiche già
esistenti in natura Questa caratteristica è
particolarmente importante per gli studi di
provenienza geografica. Siccome i processi di
vinificazione non influenzano limpronta
isotopica di origine geochimica, il vino risulta
marcato in base alla differente origine geografica
85
Determinazione di Pb con MS
La determinazione quantitativa degli isotopi di
Pb è più semplice rispetto a quella di Sr, in
quanto non ci sono problemi di interferenza
positiva, tranne che per lisotopo 204Hg che
interferisce con 204Pb tuttavia, il mercurio nei
vini è solitamente presente a concentrazioni
bassissime e decisamente inferiori a quelle di
Pb La misura degli isotopi di Pb è effettuata con
le tecniche di spettrometria di massa, nelle
varianti ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass
Spectrometry) ad alta risoluzione o TIMS (Thermal
Ionization Mass Spectrometry)
86
Esempi di studi isotopici su Pb
Nella tabella sono riportati i valori dei
rapporti isotopici di Pb nei campioni della serie
storica 1950-1991 Come si può notare, i r.i.
variano pochissimo nel tempo, essendo i vini
provenienti dallo stesso terreno
87
Confronto tra vini europei e non
Nel grafico sono evidenziati i valori di r.i. per
campioni di vino provenienti dallEuropa, dalla
California e dallAustralia. I vini europei sono
difficilmente distinguibili, ma è interessante la
netta discriminazione tra vini europei ed
extraeuropei
88
Anche in questo studio si rileva una certa
differenza tra vini europei ed extraeuropei
89
Dalla tabella dei r.i. risultano differenze
statisticamente significative
90
Valori di letteratura
91
Pb in vini italiani
In un recente studio sui vini italiani è stata
valutata la possibilità di impiegare i r.i. di Pb
dal punto di vista della classificazione
geografica. La determinazione della
concentrazione totale di Pb non è particolarmente
significativa, in quanto le numerose sorgenti di
contaminazione causano sovrapposizioni dei valori
È però interessante notare che il valore medio
più elevato si ha per i vini dellItalia
nordoccidentale, zona a elevata
industrializzazione I r.i. dei vini italiani
rientrano negli intervalli noti per i vini
europei non si registra però una netta
discriminazione tra i vini delle quattro
macroregioni considerate (nordovest, nordest,
centro, sud)