Preparazione Dei Campioni per l'Analisi Istologica

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Microscopi e tecniche Microscopiche 2 parte
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(No Transcript)
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• Taglio per mezzo di un microtomo, che produce
  sezioni dello spessore di 1-10mm.
• Montaggio delle sezioni su vetrini per
  microscopia.

Sezione non colorata
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Tagliare fettine così sottili di campioni
biologici di diversa consistenza può essere
problematico -Ecco perché occorre INCLUDERE
-Esistono diversi mezzi di inclusione che
conferiscono diversa consistenza ai campioni.
PARAFFINA RESINA MIX DI PARAFFINA E RESINE
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• Colorazione delle sezioni con il metodo più
  appropriato.
• I coloranti sono a base acquosa, per cui si
  elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo.

Colorazione automatizzata
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Colorazioni

• Colorazione con un colore brillante di certe
  componenti del tessuto
• Contro colorazione del resto del tessuto con un
  colore contrastante

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• Ematossilina/Eosina
• Ematossilina ha affinità per le molecole cariche
  negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine).
• Eosina ha affinità per le molecole cariche
  positivamente (proteine del citosol).

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Perchè questa "slide" è blu

• Se una porzione di tessuto o di una cellula si
  colora di blu/porpora, viene detta basofila
• È colorata dall'ematossilina
• Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili

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e questa rossa ?

• Se una porzione si colora in rosso /arancio
  /rosa, viene detta acidofila o eosinofila
• È colorata dall'eosina
• Sono proteine del citosol

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Altre colorazioni

• PAS
• Per sostanze ricche in zuccheri (muco)
• Tricromica
• (Azan Mallory)
• Per i tessuti connettivi
• Le fibre si colorano in blu
• Con EE sono rosa.

Adiposo Bianco
Le aree bianche sono lipidi
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• Osmio o Sudan black
• Per grasso /lipidi/mielina
• I lipidi non incorporano coloranti acquosi
• Argento ed oro
• Per fibre delicate e processi cellulari
• Giemsa
• Per le cellule del sangue
• Simile ad EE

Mielina
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Come si osserva il campione?

• Attraverso un buon microscopio ottico
• Fotografandolo
• Misurandolo

Per avere un'idea delle dimensioni delle
strutture osservate si può usare come riferimento
un eritrocita ( 8 micron)
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Interpretate il campione!!!

• Dovete pensare in 3 dimensioni
• Sezioni seriali sono l'ideale per
  l'interpretazione e la ricostruzione

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Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali
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Microscopia Elettronica a Trasmissione

• Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta
• Alta risoluzione
• Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi
• Gli elettroni passano attraverso il campione

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MICROSCOPIA ELETTRONICA
Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
limite di risoluzione di questo strumento è di
0,2 nm
Un fascio di elettroni attraversa il campione e
viene proiettato su uno schermo che trasforma in
toni di grigio il numero di elettroni da cui
viene colpito. Condensatore e obiettivo non sono
costituiti da lenti, ma da campi magnetici, che
hanno lo scopo di deviare le traiettorie degli
elettroni verso l'asse.
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La maggiore risoluzione del TEM permette di
visualizzare strutture non visibili con il
microscopio ottico Risoluzione dell'occhio 0.2
mm 200 µm Risoluzione del MO 2,000 Angstroms
200nm Risoluzione del TEM 2 Angstroms 1 mm
1000 µm 1 µm 1000 nm 1 nm 10 Angstroms
Pinocitosi
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Microscopia elettronica
-I campioni devono essere molto più sottili
di quelli per il microscopio ottico a luce
trasmessa
-Non vengono usati coloranti ma sostanze
dense agli elettroni semplicemente per dare
contrasto o anche per marcare anticorpi
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Preparatione del campione
Cellula eucariotica Nucleo interfasico

• Fissazione
• glutaraldeide
• Tetrossido osmio
• Deidratazione
• etanolo (passaggi)
• Inclusione
• Resine plastiche
• Taglio
• ultramicrotomo (spessore 50-100 nm)
• Colorazione
• Metalli pesanti

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Preparazione di Campioni Biologici per TEM

• 1 Acquisizione del campione e taglio in pezzi
  (1cm3)
• 2 Fissaggio del campione con glutaraldeide e poi
  tetrossido di osmio
• Losmio è un metallo pesante che si lega ai
  lipidi, rendendoli elettrondensi (neri)
• Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni
  appaiono chiari.

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• Disidratazione dei campioni tramite passaggi in
  soluzioni a concentrazione crescente di etanolo.
• Inclusione dei campioni in piccoli blocchi di
  resina.

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• Taglio dei campioni inclusi con un
  ultra-microtomo dotato di lama al diamante (a
  volte vetro).
• La superfice da analizzare deve essere di circa
  0.2 mm.
• Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm
  (di solito 65-80 nm).

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• Montaggio delle sezioni su di una griglia.
• Colorazione delle sezioni con nitrato o acetato
  di uranile e citrato di piombo.
• Visualizzazione al TEM
• Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

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Vari tipi di Microscopia Elettronica

• Transmissione (TEM)
• Scansione (SEM)
• Shadow-casting
• Freeze-fracture
• Freeze-etching
• CryoEM
• Negative Staining

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(No Transcript)
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Microscopia Elettronica a Scansione

• SEM fa una scansione della superfice del campione
• Produce immagini 3-D

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IL MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE (SEM)
Nel SEM (ed in genere nella microscopia elettronic
a) viene sfruttata linterazione di un fascio di
e- con il campione per ricavare informazioni sul
campione stesso come nel microscopio luce a
riflessione viene utilizzato un fascio di fotoni
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Non vengono registrati gli e- che attraversano il
campione bensì quelli secondari che sono emessi a
seguito dellurto del fascio di elettroni contro
di esso
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Tridimensionalità La caratteristica preminente
delle immagini ottenute con il SEM è
leccezionale tridimensionalità
- Ciglia e microvilli
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Glomerulo renale
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Preparazione dei campioni per SEM

• Acquisizione del campione
• Trattandolo con cura in modo da non danneggiare
  la superficie
• Fissazione e disidratazione
• Non si include

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• Poggiato su di un supporto e ricoperto con um
  metallo
• Oro, cromo, palladio, carbone
• Deve essere elettron-conducente (non
  elettrondenso)
• Visualizzato al microscopio
• Fotografato
• Si possono analizzare le componenti chimiche
  tramite raggi X